激素對小鼠胚胎體外發育的影響
摘要探討小鼠胚胎體外發育過程中,2種激素***孕馬血清促性腺激素PMSG、人絨毛膜促性腺激素HCG***對早期胚胎髮育的影響。取原核期胚胎培養於不同的培養體系中,確定適合胚胎髮育的最佳體外培養體系;在胚胎培養液中加入不同濃度的激素,觀察激素對體外發育的影響。試驗發現含10%胎牛血清的人輸卵管液培養液***HTF***是該試驗條件下小鼠早期胚胎髮育的最佳培養液;在該培養液中新增不同濃度和不同種類的激素後,各發育階段胚胎的發育率與未新增激素的對照組相比均有所下降,但未發現濃度依賴性。由此可認為,高濃度的PMSG和HCG對體外培養的胚胎髮育有抑制作用,可降低胚胎髮育到各階段的比例,尤其是顯著降低了囊胚的發生率。
關鍵詞激素;小鼠胚胎;體外發育;影響
AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.
早期胚胎體外培養技術在發育生物學、胚胎移植、轉基因動物等領域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎髮育是一個複雜的過程,在此過程中,可受到各種激素的影響,激素通過不同途徑來調控早期胚胎髮育[2,3]。目前,在不孕治療中經常使用到各種促排卵激素,在孕婦妊娠期間也經常使用一些激素類藥物,有報道,使用不同劑量和不同種類的激素,可能影響到胚胎的質量[4-7]。另外,環境中也存在著多種激素的類似物,這些激素和激素類似物對胚胎髮育的影響研究,目前還缺乏系統性,尤其是較高濃度的激素水平如何影響胚胎的發育、胚胎髮育與激素的濃度之間是否存在著劑量依存性、同種激素對不同發育階段的胚胎的影響等,這些都還不十分明瞭,很有必要進行深入的研究。本研究旨在以小鼠為試驗動物模型,在基礎胚胎髮育培養液中分別加入不同種類和不同濃度的激素,以探討其對鼠早期胚胎體外發育的影響機理。
1材料與方法
1.1試驗試劑
孕馬血清促性腺激素***PMSG***和人絨毛膜促性腺激素***HCG***購自寧波第二激素廠,HTF培養液購於美國In-Vitro公司,透明質酸酶購自Vitrolife公司,BSA 粉劑購自BovomaX公司,FBS***胎牛血清***購自Gibco公司。胚胎操作液配製:CZB-HEPES***NaCl為478.9mg/100mL,KCl為36.3mg/100mL,KH2PO4為15.9mg/100mL,MgSO4為14.195mg/100mL,NaHCO3為210.0mg/100mL,C6H12O6為100.0mg/100mL,CaCl2·2H2O為25.0mg/100mL,乳酸鈉***60%糖漿***為370mg/100mL,鏈黴素為50mg/100mL,青黴素為60mg/100mL,HEPES為238.0 mg/100mL***。使用時,新增BSA粉劑4mg/mL,過濾除菌,使用前加溫,用於體外胚胎的收集和清洗操作。
1.2試驗動物及處理
昆明品系性成熟小鼠,6～8周齡,購自浙江中醫藥大學動物實驗中心,飼養於光照控制***10L∶14D***、恆溫恆溼的飼養室,自由採食飲水。雌鼠於17∶30左右腹腔注射10IU孕馬血清促性腺激素***PMSG***,48h後腹腔注射10IU人絨毛膜促性腺激素***HCG***,HCG注射後與正常雄鼠按1∶1比例合籠,次日清晨檢查有無陰栓。有陰栓者於注射HCG後14～21h採用頸椎脫臼法處死小鼠。
1.3胚胎收集
取出輸卵管移入操作液,在體視顯微鏡下找到輸卵管膨大部,劃破輸卵管膨大部使受精卵***雲霧狀***遊離出來。用槍頭吸出卵團,移入含透明質酸酶的液滴中反覆吹打,鏡下觀察,當受精卵遊離出來後,用移卵管***自制巴氏管***吸出來移入新液滴內清洗3次,備用。
1.4試驗分組與胚胎培養
1.4.1檢查通過2-細胞阻滯情況。收集洗淨的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為2組,分別置於HTF+10% FBS和HTF+4mg/mL BSA培養液小滴中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,24h後觀察2-細胞發育情況並做好記錄。
1.4.2檢查培養體系。收集洗淨的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置於HTF+10% FBS培養液小滴中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,每 24h觀察1次,並記錄各發育階段胚胎數目。
1.4.3激素對胚胎髮育的影響。選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置於新增100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mL PMSG的HTF+10%FBS培養液中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,每24h觀察發育情況,並記錄各發育階段的胚胎個數。以不新增激素的HTF+10%FBS培養液作為對照組***CK***。
2結果與分析
2.1培養液中新增FBS和BSA檢查培養系統突破2-細胞阻滯效果
在試驗體系中,分別在HTF培養液中新增胎牛血清-FBS***10%***和牛血清白蛋白-BSA***4mg/mL***,檢查培養系統能否突破小鼠胚胎髮育的2-細胞阻滯情況,結果發現:新增FBS和選購的BSA均可以使原核期胚胎突破2-細胞阻滯,而以新增血清效果較好,在以下的試驗中將選擇HTF新增血清作為基礎培養液***見表1***。
2.2培養體系檢查
應用HTF+FBS培養原核期胚胎,可以平均獲得2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚的比例分別為80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各發育階段胚胎個數的具體數值見表2。
2.3小鼠胚胎髮育各階段的顯微攝影
培養後每間隔24h,在相差顯微鏡下觀察胚胎的發育情況,並拍照,各發育階段胚胎的形態如圖1所示。各發育階段胚胎髮育正常,培養系統相對穩定。
2.4激素對小鼠原核胚胎體外發育的影響
不同濃度的結果見表3。由表3可知,新增激素後,各發育階段胚胎的發育率與對照組相比均有所下降,原核期胚胎的2-細胞發生率與對照組相比有所下降,但未發現濃度依賴性;新增不同濃度的HCG使4-細胞胚胎及其後的各階段胚胎髮育下降尤為明顯,並且未發現發育到囊胚階段;新增不同濃度的PMSG,囊胚的發育率與對照組之間也存在著顯著差異;新增HCG似乎可以降低胚胎異常分裂率,而新增PMSG 似乎使異常分裂胚胎的比例升高,具體情況如何還需要深入的研究。
3結論與討論
胚胎的早期發育過程中,很容易受到激素的影響,在輔助生殖實施過程中,往往需要使用激素進行超數排卵處理,激素對早期胚胎的發育影響研究可以為人類輔助生殖技術提高成功率提供一定的理論基礎。近年來,隨著動物胚胎工程的發展,試管動物、轉基因動物和體細胞核移植動物已相繼出現,而生產這些動物的一個關鍵步驟就是胚胎的體外培養,獲得穩定的體外發育率是這些技術廣泛推廣的基礎。
試驗發現,應用HTF新增10%血清的培養系統可以很好地支援小鼠胚胎體外發育,使用的系統在多次試驗檢測過程中相對比較穩定,幾次試驗培養的原核期***1-細胞期***胚胎可以在體外發生分裂,並可以發育到囊胚階段。
昆明品系小鼠早期胚胎體外培養中表現出嚴重2-細胞阻滯現象[8],應用模擬輸卵管培養液新增血清和血清白蛋白的方式可以突破2-細胞阻滯,在本研究中進口血清突破2-細胞阻滯的效果要好於選購的BSA。這可能與血清中含有多種促進胚胎髮育的細胞因子有關[9]。
PMSG和HCG這2種激素經常被用於動物的超數排卵。孕馬血清促性腺激素***Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG***具有體內的FSH和LH的作用,而人絨毛膜促性腺激素***Human chorionic gonadotropin,HCG***是模擬體內LH的作用,促進黃體發育,FSH和LH二者在體內促進卵泡發育、排卵和黃體發育。HCG由人胎盤和胞體滋養層細胞合成,現已可高度純化,並可由基因重組生成。自1978年首例經體外受精胚胎植入創造的Louise Brown誕生後,近10餘年來隨著ART技術的進展,HCG的臨床應用也日益廣泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明瞭。雖然HCG對維持黃體功能是必需的,在不孕症患者誘導排卵出現黃體功能障礙時,重複給予HCG能有效地支援黃體功能[10],但也有HCG溶解黃體的報道,試驗表明在大鼠、小鼠、兔和羊於胚胎植入前和植入時,給予1次或多次HCG,會導致產生不同程度的胚胎死亡[11]。特別是最近用促性腺激素誘導排卵,在體內或體外受精治療不孕症時,常繼之出現縮短黃體期致胚胎植入失敗、妊娠率降低等現象,其機理也還很少闡明。在程渭玉等[12]的研究中也表明HCG對胚胎的毒性,且存在時間、劑量依賴關係。試驗新增不同濃度的HCG使4-細胞胚胎及其後的各階段胚胎髮育下降尤為明顯,並且未發現發育到囊胚階段的胚胎。
PMSG在母馬妊娠38~40d時可以檢測出,60d時達到高峰,而在120d時開始下降,170d時下降到檢測不出的水平;HCG在非孕婦女處於較低水平,在胚胎髮育早期也處於低水平,在妊娠第2周以後顯著增加。近來也有學者研究認為胚胎體外發育與激素PMSG、HCG存在關聯[13],其他激素也可能影響到胚胎的質量[14-16]。在輔助生殖和超數排卵過程中,需要使用高濃度的PMSG和HCG,在血中二者的濃度高於正常值。在培養體系中新增高濃度的PMSG和HCG,調查其對早期胚胎髮育的影響,研究發現胚胎暴露在高濃度的PMSG和HCG降低了胚胎體外發育到各階段的比例,尤其是明顯降低了囊胚的發生率,而HCG對胚胎體外發育的影響似乎更大。由於所調查的樣本還較小,其具體情況和具體機制等尚需要深入研究,下一步將擴大試驗次數並深入研究多種激素的聯合作用對胚胎體外早期發育的影響。
4參考文獻
[1] GARDNER D K,LANE M.Amino acids and ammonium regulate Mouse ova from Two-cel1 to Blastocyst[J].Biol Reprod,1993,48***2***:377-385.
[2] DE CASTRO M P,CORTELL C,MOCE E,et al.Effect of recombinant gonadotropins on embryo quality in superovulated rabbit does and immune response after repeated treatments[J].Theriogenology,2009,72***5***:655-662.
[3] ASHKAR F A,SEMPLE E,SCHMIDT C H,et al.Thyroid hormone supp-lementation improves bovine embryo development in vitro[J].Hum Reprod,2009***17***:339-344.
[4] ABATE A,NAZZARO A,SALERNO A,et al.Efficacy of recombinant versus human derived follicle stimulating hormone on the oocyte and embryo quality in IVF-ICSI trial[J].Gynecol Endocrinol,2009,25***8***:479-484.
[5] KRAUSE B T,OHLINGER R,HAASE A.Lutropin alpha,recombinant human luteinizing hormone,for the stimulation of follicular development in profoundly LH-deficient hypogonadotropic hypogonadal women:a re-view[J].Biologics,2009***3***:337-347.
[6] MELO M,BUSSO C E,BELLVER J,et al.GnRH agonist versus recomb-inant HCG in an oocyte donation programme:a randomized,prospective,***下轉第323頁***
***上接第321頁***
controlled,assessor-blind study[J].Reprod Biomed Online,2009,19***4***:486-492.
[7] GUERIF F,LEMSEFFER M,COUET M L,et al.Serum antimüllerian hormone is not predictive of oocyte quality in vitro fertilization[J].Ann Endocrinol***Paris***,2009,70***4***:230-234.
[8] 李逸平,左嘉客.哺乳動物早期胚胎髮育組織的形成與突破[J].細胞生物學雜誌,1992,14***2***:135-138.
[9] PINYOPUMMINTR T,BAVISTER B D.In vitro-matured/in vitro-fertil-ized bovine oocytes can development intomorulae/blastocysts in chemi-cally defined,protein—free culture media[J].Biol Reprod,1991,45***5***:736-742.
[10] BLUMENFELD Z,NAHHAS F.Luteal dysfunction in ovulation role of repetitive human chorionic gonadotropin supplem-entation during the luteal phase[J].Fertil Steril,1988,50***3***:403-407.
[11] HAHN D W,ALLEN G,MCGUIRE J L.A relationship between estrog-enicity and antifertility activity of 1-diphenylmethylenyl-2-methyl-3-ethyl-4-acetoxycyclohexane***ORF 8511***and similar nonsteroidal anti-implantive agents[J].Contraception,1974,9***4***:393-401.
[12] 程渭玉,GOH H H,陳覺生.人絨毛膜促性腺激素對早期胚胎髮育的影響[J].天津醫藥,1992,20***1***:37-40.
[13] MARTIN-COELLO J,GONZALEZ R,CRESPO C,et al. Superovulation and in vitro oocyte maturation in three species of mice***Mus musculus,Mus spretus and Mus spicilegus***[J].Theriogenology,2008,70***6***:1004-1013.
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關鍵詞激素;小鼠胚胎;體外發育;影響
AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.
早期胚胎體外培養技術在發育生物學、胚胎移植、轉基因動物等領域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎髮育是一個複雜的過程,在此過程中,可受到各種激素的影響,激素通過不同途徑來調控早期胚胎髮育[2,3]。目前,在不孕治療中經常使用到各種促排卵激素,在孕婦妊娠期間也經常使用一些激素類藥物,有報道,使用不同劑量和不同種類的激素,可能影響到胚胎的質量[4-7]。另外,環境中也存在著多種激素的類似物,這些激素和激素類似物對胚胎髮育的影響研究,目前還缺乏系統性,尤其是較高濃度的激素水平如何影響胚胎的發育、胚胎髮育與激素的濃度之間是否存在著劑量依存性、同種激素對不同發育階段的胚胎的影響等,這些都還不十分明瞭,很有必要進行深入的研究。本研究旨在以小鼠為試驗動物模型,在基礎胚胎髮育培養液中分別加入不同種類和不同濃度的激素,以探討其對鼠早期胚胎體外發育的影響機理。
1材料與方法
1.1試驗試劑
孕馬血清促性腺激素***PMSG***和人絨毛膜促性腺激素***HCG***購自寧波第二激素廠,HTF培養液購於美國In-Vitro公司,透明質酸酶購自Vitrolife公司,BSA 粉劑購自BovomaX公司,FBS***胎牛血清***購自Gibco公司。胚胎操作液配製:CZB-HEPES***NaCl為478.9mg/100mL,KCl為36.3mg/100mL,KH2PO4為15.9mg/100mL,MgSO4為14.195mg/100mL,NaHCO3為210.0mg/100mL,C6H12O6為100.0mg/100mL,CaCl2·2H2O為25.0mg/100mL,乳酸鈉***60%糖漿***為370mg/100mL,鏈黴素為50mg/100mL,青黴素為60mg/100mL,HEPES為238.0 mg/100mL***。使用時,新增BSA粉劑4mg/mL,過濾除菌,使用前加溫,用於體外胚胎的收集和清洗操作。
1.2試驗動物及處理
昆明品系性成熟小鼠,6～8周齡,購自浙江中醫藥大學動物實驗中心,飼養於光照控制***10L∶14D***、恆溫恆溼的飼養室,自由採食飲水。雌鼠於17∶30左右腹腔注射10IU孕馬血清促性腺激素***PMSG***,48h後腹腔注射10IU人絨毛膜促性腺激素***HCG***,HCG注射後與正常雄鼠按1∶1比例合籠,次日清晨檢查有無陰栓。有陰栓者於注射HCG後14～21h採用頸椎脫臼法處死小鼠。
1.3胚胎收集
取出輸卵管移入操作液,在體視顯微鏡下找到輸卵管膨大部,劃破輸卵管膨大部使受精卵***雲霧狀***遊離出來。用槍頭吸出卵團,移入含透明質酸酶的液滴中反覆吹打,鏡下觀察,當受精卵遊離出來後,用移卵管***自制巴氏管***吸出來移入新液滴內清洗3次,備用。
1.4試驗分組與胚胎培養
1.4.1檢查通過2-細胞阻滯情況。收集洗淨的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為2組,分別置於HTF+10% FBS和HTF+4mg/mL BSA培養液小滴中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,24h後觀察2-細胞發育情況並做好記錄。
1.4.2檢查培養體系。收集洗淨的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置於HTF+10% FBS培養液小滴中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,每 24h觀察1次,並記錄各發育階段胚胎數目。
1.4.3激素對胚胎髮育的影響。選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置於新增100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mL PMSG的HTF+10%FBS培養液中。於37℃、5% CO2、95%空氣、飽和溼度的培養箱中培養,每24h觀察發育情況,並記錄各發育階段的胚胎個數。以不新增激素的HTF+10%FBS培養液作為對照組***CK***。
2結果與分析
2.1培養液中新增FBS和BSA檢查培養系統突破2-細胞阻滯效果
在試驗體系中,分別在HTF培養液中新增胎牛血清-FBS***10%***和牛血清白蛋白-BSA***4mg/mL***,檢查培養系統能否突破小鼠胚胎髮育的2-細胞阻滯情況,結果發現:新增FBS和選購的BSA均可以使原核期胚胎突破2-細胞阻滯,而以新增血清效果較好,在以下的試驗中將選擇HTF新增血清作為基礎培養液***見表1***。
2.2培養體系檢查
應用HTF+FBS培養原核期胚胎,可以平均獲得2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚的比例分別為80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各發育階段胚胎個數的具體數值見表2。
2.3小鼠胚胎髮育各階段的顯微攝影
培養後每間隔24h,在相差顯微鏡下觀察胚胎的發育情況,並拍照,各發育階段胚胎的形態如圖1所示。各發育階段胚胎髮育正常,培養系統相對穩定。
2.4激素對小鼠原核胚胎體外發育的影響
不同濃度的結果見表3。由表3可知,新增激素後,各發育階段胚胎的發育率與對照組相比均有所下降,原核期胚胎的2-細胞發生率與對照組相比有所下降,但未發現濃度依賴性;新增不同濃度的HCG使4-細胞胚胎及其後的各階段胚胎髮育下降尤為明顯,並且未發現發育到囊胚階段;新增不同濃度的PMSG,囊胚的發育率與對照組之間也存在著顯著差異;新增HCG似乎可以降低胚胎異常分裂率,而新增PMSG 似乎使異常分裂胚胎的比例升高,具體情況如何還需要深入的研究。
3結論與討論
胚胎的早期發育過程中,很容易受到激素的影響,在輔助生殖實施過程中,往往需要使用激素進行超數排卵處理,激素對早期胚胎的發育影響研究可以為人類輔助生殖技術提高成功率提供一定的理論基礎。近年來,隨著動物胚胎工程的發展,試管動物、轉基因動物和體細胞核移植動物已相繼出現,而生產這些動物的一個關鍵步驟就是胚胎的體外培養,獲得穩定的體外發育率是這些技術廣泛推廣的基礎。
試驗發現,應用HTF新增10%血清的培養系統可以很好地支援小鼠胚胎體外發育,使用的系統在多次試驗檢測過程中相對比較穩定,幾次試驗培養的原核期***1-細胞期***胚胎可以在體外發生分裂,並可以發育到囊胚階段。
昆明品系小鼠早期胚胎體外培養中表現出嚴重2-細胞阻滯現象[8],應用模擬輸卵管培養液新增血清和血清白蛋白的方式可以突破2-細胞阻滯,在本研究中進口血清突破2-細胞阻滯的效果要好於選購的BSA。這可能與血清中含有多種促進胚胎髮育的細胞因子有關[9]。
PMSG和HCG這2種激素經常被用於動物的超數排卵。孕馬血清促性腺激素***Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG***具有體內的FSH和LH的作用,而人絨毛膜促性腺激素***Human chorionic gonadotropin,HCG***是模擬體內LH的作用,促進黃體發育,FSH和LH二者在體內促進卵泡發育、排卵和黃體發育。HCG由人胎盤和胞體滋養層細胞合成,現已可高度純化,並可由基因重組生成。自1978年首例經體外受精胚胎植入創造的Louise Brown誕生後,近10餘年來隨著ART技術的進展,HCG的臨床應用也日益廣泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明瞭。雖然HCG對維持黃體功能是必需的,在不孕症患者誘導排卵出現黃體功能障礙時,重複給予HCG能有效地支援黃體功能[10],但也有HCG溶解黃體的報道,試驗表明在大鼠、小鼠、兔和羊於胚胎植入前和植入時,給予1次或多次HCG,會導致產生不同程度的胚胎死亡[11]。特別是最近用促性腺激素誘導排卵,在體內或體外受精治療不孕症時,常繼之出現縮短黃體期致胚胎植入失敗、妊娠率降低等現象,其機理也還很少闡明。在程渭玉等[12]的研究中也表明HCG對胚胎的毒性,且存在時間、劑量依賴關係。試驗新增不同濃度的HCG使4-細胞胚胎及其後的各階段胚胎髮育下降尤為明顯,並且未發現發育到囊胚階段的胚胎。
PMSG在母馬妊娠38~40d時可以檢測出,60d時達到高峰,而在120d時開始下降,170d時下降到檢測不出的水平;HCG在非孕婦女處於較低水平,在胚胎髮育早期也處於低水平,在妊娠第2周以後顯著增加。近來也有學者研究認為胚胎體外發育與激素PMSG、HCG存在關聯[13],其他激素也可能影響到胚胎的質量[14-16]。在輔助生殖和超數排卵過程中,需要使用高濃度的PMSG和HCG,在血中二者的濃度高於正常值。在培養體系中新增高濃度的PMSG和HCG,調查其對早期胚胎髮育的影響,研究發現胚胎暴露在高濃度的PMSG和HCG降低了胚胎體外發育到各階段的比例,尤其是明顯降低了囊胚的發生率,而HCG對胚胎體外發育的影響似乎更大。由於所調查的樣本還較小,其具體情況和具體機制等尚需要深入研究,下一步將擴大試驗次數並深入研究多種激素的聯合作用對胚胎體外早期發育的影響。
4參考文獻
[1] GARDNER D K,LANE M.Amino acids and ammonium regulate Mouse ova from Two-cel1 to Blastocyst[J].Biol Reprod,1993,48***2***:377-385.
[2] DE CASTRO M P,CORTELL C,MOCE E,et al.Effect of recombinant gonadotropins on embryo quality in superovulated rabbit does and immune response after repeated treatments[J].Theriogenology,2009,72***5***:655-662.
[3] ASHKAR F A,SEMPLE E,SCHMIDT C H,et al.Thyroid hormone supp-lementation improves bovine embryo development in vitro[J].Hum Reprod,2009***17***:339-344.
[4] ABATE A,NAZZARO A,SALERNO A,et al.Efficacy of recombinant versus human derived follicle stimulating hormone on the oocyte and embryo quality in IVF-ICSI trial[J].Gynecol Endocrinol,2009,25***8***:479-484.
[5] KRAUSE B T,OHLINGER R,HAASE A.Lutropin alpha,recombinant human luteinizing hormone,for the stimulation of follicular development in profoundly LH-deficient hypogonadotropic hypogonadal women:a re-view[J].Biologics,2009***3***:337-347.
[6] MELO M,BUSSO C E,BELLVER J,et al.GnRH agonist versus recomb-inant HCG in an oocyte donation programme:a randomized,prospective,***下轉第323頁***
***上接第321頁***
controlled,assessor-blind study[J].Reprod Biomed Online,2009,19***4***:486-492.
[7] GUERIF F,LEMSEFFER M,COUET M L,et al.Serum antimüllerian hormone is not predictive of oocyte quality in vitro fertilization[J].Ann Endocrinol***Paris***,2009,70***4***:230-234.
[8] 李逸平,左嘉客.哺乳動物早期胚胎髮育組織的形成與突破[J].細胞生物學雜誌,1992,14***2***:135-138.
[9] PINYOPUMMINTR T,BAVISTER B D.In vitro-matured/in vitro-fertil-ized bovine oocytes can development intomorulae/blastocysts in chemi-cally defined,protein—free culture media[J].Biol Reprod,1991,45***5***:736-742.
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