2017高中生物選修一必考考點***2***
高中生物微生物的培養與應用
課題一 微生物的實驗室培養
·培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配製出供其生長繁殖的營養基質，是進行微生物培養的物質基礎。
·培養基按照物理性質可分為液體培養基 半固體培養基和固體培養基。在液體培養基中加入凝固劑瓊脂***是從紅藻中提取的一種多糖，在配製培養基中用作凝固劑***後，製成瓊脂固體培養基。微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據菌落的特徵可以判斷是哪一種菌。液體培養基應用於工業或生活生產，固體培養基應用於微生物的分離和鑑定，半固體培養基則常用於觀察微生物的運動及菌種保藏等。
·按照成分培養基可分為人工合成培養基和天然培養基。合成培養基是用成分已知的化學物質配製而成，其中成分的種類比例明確，常用於微生物的分離鑑定。天然培養基是用化學成分不明的天然物質配製而成，常用於實際工業生產。
·按照培養基的用途，可將培養基分為選擇培養基和鑑定培養基。選擇培養基是指在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑑別培養基是根據微生物的特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品配製而成的，用以鑑別不同類別的微生物。
·培養基的化學成分包括 水 、 無機鹽 、 碳源 、 氮源 ***生長因子***等。
·碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養微生物只能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。
·氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質。如N2、NH3、NO3-、NH4+***無機氮源***蛋白質、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白腖***有機氮源***等。只有固氮微生物才能利用N2。
·培養基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養物質以及氧氣的要求。例如，培養乳酸桿菌時需要在培養基中新增維生素，培養黴菌時須將培養基的pH調至酸性，培養細菌是需要將pH調至中性或微鹼性，培養厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件
·無菌技術·獲得純淨培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。
②將用於微生物培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。
③為避免周圍環境中微生物的汙染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物汙染外，還有什麼目的?
答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。
·消毒與滅菌的區別
消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物***不包括芽孢和孢子***。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法***對於一些不耐高溫的液體***還有化學藥劑***如酒精、氯氣、石炭酸等***消毒、紫外線消毒。
滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、乾熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。
滅菌方法：
①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;
②玻璃器皿、金屬用具等使用乾熱滅菌法，所用器械是乾熱滅菌箱 ;
③培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。
④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。
***1***方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。 製作牛肉膏蛋白腖固體培養基
***2***倒平板操作的步驟：
①將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞。
②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。
③用左手的拇指和食指將培養皿開啟一條稍大於瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養基***約10～20mL***倒入培養皿，左手立即蓋上培養皿的皿蓋。
④等待平板冷卻凝固，大約需5～10min。然後，將平板倒過來放置，使培養皿蓋在下、皿底在上。
·倒平板操作的討論
1.培養基滅菌後，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什麼辦法來估計培養基的溫度?
提示：可以用手觸控盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。
2.為什麼需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?
答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物汙染培養基。
3.平板冷凝後，為什麼要將平板倒置?
答：平板冷凝後，皿蓋上會凝結水珠，將平板倒置，既可以防止培養基表面的水分過度地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成汙染。
4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎?為什麼?
答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。
純化大腸桿菌
***1***微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋塗布平板法。
***2***平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。在數次劃線後培養，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。
***3***稀釋塗布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然後將不同稀釋度的菌液分別塗布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。分為系列稀釋操作和塗布平板操作兩步。
***4***用平板劃線法和稀釋塗布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便於純化菌種。
***5***平板劃線法操作步驟：
①將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅。②在火焰旁冷卻接種環，並開啟棉塞。
③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環伸入菌液中蘸取一環菌液。
⑤將試管通過火焰，並塞上棉塞。⑥左手將皿蓋開啟一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養皿。⑦灼燒接種環，待其冷卻後，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重複以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最後一區的劃線與第一區相連。⑧將平板倒置放入培養箱中培養。
·平板劃線操作的討論
1.為什麼在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環?在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎?為什麼?
答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物汙染培養物;每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束後，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源於上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束後灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌汙染環境和感染操作者。
2.在灼燒接種環之後，為什麼要等其冷卻後再進行劃線?
答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。
3.在作第二次以及其後的劃線操作時，為什麼總是從上一次劃線的末端開始劃線?
答：劃線後，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
***6***塗布平板操作的步驟：
①將塗布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養基表面。
③將沾有少量酒精的塗布器在火焰上引燃，待酒精燃盡後，冷卻8～10s。
④用塗布器將菌液均勻地塗布在培養基表面。
塗布平板操作的討論
塗布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作?
提示：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。
菌種的儲存
***1***對於頻繁使用的菌種，可以採用臨時保藏的方法。
①臨時保藏方法
將菌種接種到試管的固體斜面培養基上，在合適的溫度下培養。當菌落長成後，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以後每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養基上轉移到新鮮的培養基上。
②缺點：這種方法儲存的時間不長，菌種容易被汙染或產生變異。
***2***對於需要長期儲存的菌種，可以採用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油後滅菌。將1mL培養的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻後，放在-20℃的冷凍箱中儲存。
疑難解答
***1***生物的營養
營養是指生物攝取、利用營養物質的過程。營養物質是指維持機體生命活動，保證發育、生殖所需的外源物質。
人及動物的營養物質：水、無機鹽、糖類、脂質、蛋白質、維生素六類。
植物的營養物質：礦質元素、水、二氧化碳等三類。
微生物的營養物質：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養物質五類。
***2***確定培養基製作是否合格的方法
將未接種的培養基在恆溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養基的製備是成功的，否則需要重新制備。
課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
尿素 是一種重要的農業氮肥，尿素並不能直接被農作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之後，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶
尿素最初是從人的尿液中發現的
篩選菌株
***1***實驗室中微生物的篩選應用的原理
人為提供有利於目的菌株生長的條件***包括營養、溫度、pH等***，同時抑制或阻止其他微生物生長。
***2***選擇性培養基
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱作選擇培養基。
***3***配製選擇培養基的依據
根據選擇培養的菌種的生理代謝特點加入某種物質以達到選擇的目的。例如，培養基中不加入有機物可以選擇培養自養微生物;培養基中不加入氮元素，可以選擇培養能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養金黃色葡萄球菌等。
統計菌落數目
***1***測定微生物數量的常用方法有稀釋塗布平板法和顯微鏡直接計數。
***2***稀釋塗布平板法統計樣品中活菌的數目的原理
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源於樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結果準確，一般設定3～5個平板，選擇菌落數在30～300的平板進行計數，並取平均值。統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。
採用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數在30~300之間的平板進行計數
2.為了防止菌落蔓延，影響計數，可在培養基中加入TTC***在計數瓊脂中加入適量的TTC***0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中***,細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義***.
3.本法僅限於形成菌落的微生物
設定對照
設定對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。
實驗設計
實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。
***1***土壤取樣：同其他生物環境相比，土壤中的微生物，數量最大，種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮溼、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。
***2***樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數目。在實際操作中，通常選用一定稀釋範圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數在30~300之間、適於計數的平板。
測定土壤中細菌的數量，一般選用104 105 106
測定放線菌的數量，一般選用103 104 105
測定真菌的數量，一般選用102 103 104
***3***微生物的培養與觀察
不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌30~37℃ 1~2天
放線菌25~28℃ 5~7天 黴菌25~28℃ 3~4天
每隔24小時統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致一樓菌落的數目。一般來說，在一定的培養條件下***相同的培養基、溫度及培養時間***，同種微生物表現出穩定的菌落特徵。形狀、大小、隆起程度、顏色
疑難解答
***1***如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數?
統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值
每克樣品中的菌落數=***C/V****M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表塗布平板時所用的稀釋液的體積***ml***，M代表稀釋倍數
課題三 分解纖維素的微生物的分離
纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。
纖維素與纖維素酶
***1***棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。
***2***纖維素酶是一種複合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養。
纖維素分解菌的篩選
***1***篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。
***2***剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理
剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色複合物，但並不和水解後的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色複合物。當纖維素被纖維素酶分解後，剛果紅-纖維素的複合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。
分離分解纖維素的微生物的實驗流程
土壤取樣→選擇培養***此步是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來確定***→梯度稀釋→將樣品塗布到鑑別纖維素分解菌的培養基上→挑選產生透明圈的菌落
***1***土壤採集 選擇富含纖維素的環境。
***2***剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、製備菌懸液、塗布平板
***3***剛果紅染色法種類
一種是先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。
課題延伸
對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選後，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵產纖維素酶的實驗，纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素後所產生的葡萄糖進行定量的測定。
疑難解答
***1***為什麼要在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌?
由於生物與環境的相互依存關係，在富含纖維素的環境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的機率要高於普通環境。
***2***將濾紙埋在土壤中有什麼作用?你認為濾紙應該埋進土壤多深?
將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設定纖維素分解菌生存的適宜環境。一般應將紙埋於深約10cm左右腐殖土壤中。
***3***兩種剛果紅染色法的比較
方法一是傳統的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發生混雜;其優點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由於纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有澱粉類物質，可以使能夠產生澱粉酶的微生物出現假陽性反應。但這種只產生澱粉酶的微生物產生的透明圈較為模糊，因為培養基中纖維素佔主要地位，因此可以與纖維素酶產生的透明圈相區分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區分。
***4***為什麼選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物?
在選擇培養的條件下，可以使那些能夠適應這種營養條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。