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談補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血損傷血腦屏障的影響
腦血管疾病是當前導致人類死亡和殘障的主要原因之一,其中80%左右為缺血性腦血管疾病,且有逐年上升和年輕化的趨勢。補陽還五湯為清代名醫王清任所創的中醫經典方劑,原方載於《醫林改錯下卷癱痿論》,是治療半身不遂、癱痿不用諸症的首選方。前期研究表明,補陽還五湯可擴張腦血管、改善腦迴圈、對抗腦缺血後興奮性氨基酸的毒性等。本實驗採用大鼠大腦中動脈阻斷***MCAO***模型,觀察補陽還五湯對血清中血管性血友病因子***vWF***及腦組織中血管內皮生長因子***VEGF***、基質金屬蛋白酶***MMP***-2、MMP-9 表達的影響,進一步闡述該方抗腦缺血的機理。
1 實驗材料
1.1 動物
健康雄性SPF 級SD 大鼠64 只,12 周齡,體質量***28020***g,購於中國人民解放軍軍事醫學科學院動物中心,許可證號：SCXK***軍***2004-2009。
1.2 藥物與試劑
補陽還五湯由黃芪120 g、當歸6 g、川芎3 g、地龍3 g、赤芍5 g、紅花3 g、桃仁3 g 組成,北京大學醫學院提供,經水煎、濃縮製成1 g 原藥材/mL的溶液; 2,3,5- 三苯基氯化四氮唑***TTC*** ： 美國***aMResco 公司,批號0765***。大鼠MMP-2、MMP-9、VEGF、vWF ELISA 試劑盒：美國RB 公司,規格96T,購於北京尚柏試劑有限公司***批號分別為63120912、28120811、27121009、52121203***。
1.3 主要儀器
電子分析天平***AE160 型,瑞士Mettler 公司***,手術顯微鏡***SXP-1B,上海醫用光學儀器廠***,1411 型高頻小電刀***上海醫療器械技術公司***,低溫高速離心機***Sigma 公司***,光學顯微鏡***日本OLYMPUS 公司***,切片掃描器***蔡司光學儀器有限公司***,顯微影象分析系統***日本尼康公司***。
2 實驗方法
2.1 造模
根據Longa 等報道的線栓法建立大鼠永久性腦缺血模型。10%水合氯醛溶液***0.35 mg/kg 體質量***腹腔注射麻醉後將大鼠仰位固定,常規碘酒、酒精消毒頸部面板。頸部正中作約2.5 cm 切口,暴露左側頸動脈三角,在手術顯微鏡下逐層分離組織,剝離左側頸總動脈***CCA***、頸外動脈***ECA***、頸內動脈***ICA***。電刀凝閉ECA 的分支甲狀腺動脈、ECA 與ICA 之間的枕動脈,結紮遊離ECA 主幹,分離ICA 主幹至翼顎動脈***PPA***,用無損動脈夾分別夾閉CCA、ICA 和PPA,用虹膜剪在ECA 殘端剪一楔形小口,由此插入釣魚線***直徑0.25 mm,頭端呈直徑約0.3 mm 的圓球形***,輕推釣魚線使之由ECA 通過分叉部進入ICA,至大腦中動脈的起點,阻斷大腦中動脈的血液供應。尼龍線插入深度由分叉處計算約18～22 mm。縫合頸部切口,假手術組手術過程與模型組相同,分離出左側CCA 及ECA、ICA,僅結紮ECA。用縫合線結紮ECA 殘端,剪斷多餘栓線,術區使用青黴素粉少許,逐層縫合手術切口。待清醒後,參照Bedersont 等的評分方法,3 分者為造模成功。假手術組手術過程與模型組相同,但只結紮ECA遠心端,不插入栓線阻塞血管。
2.2 分組與給藥將造模成功的大鼠按照神經功能評分均勻分組,分為模型組和補陽還五湯組。補陽還五湯組大鼠給予補陽還五湯水煎液,給藥劑量為1.26 g 原藥材/100 g體質量***相當於臨床成人日用量的6.3 倍***,造模後24 h 立即灌胃,之後每日稱大鼠體質量,計算給藥量,於相同時間點給藥1 次;假手術組和模型組給予等量生理鹽水。連續給藥6 d,第7 日進行神經功能評分並處死取材。2.3 檢測方法及觀察指標2.3.1 神經功能評分 參考Bederson 等方法,總分10 分。
①提鼠尾,觀察右前肢表現。1 分：內收,但不貼身;2 分：內收,貼於身體;3 分：內收貼於身體並踡縮;4 分：大鼠軀體向右側旋轉。
②評價兩前肢肌張力：將動物置於一金屬網上,向後輕提鼠尾,觀察兩側前肢肌張力。0 分：兩側前肢緊拉金屬網肌力無明顯差別者;1 分：右前肢拉金屬網但肌力明顯弱於左側;2 分：右前肢不能拉金屬網。
③將動物置一光滑平面,觀察側向推擋阻力。0 分：雙側推擋阻力無明顯差別;1 分：右側推擋阻力明顯弱於左側;2 分：右推大鼠時其向右側傾倒。
④大鼠左眼上瞼下垂,左眼分泌物增多者評2 分。以上4 項評分相加為最後神經功能評分。
2.3.2 大鼠腦梗死體積檢測
造模後第7 日,將麻醉大鼠斷頭取全腦後迅速放於-20 ℃冰箱中凍存15 min後,距額極2 mm 開始,以視交叉水平為中心,間隔2 mm做連續冠狀切片,每個腦塊切5 片,迅速投入5 mL1%TTC 溶液中,置37 ℃孵箱孵育30 min,避光。正常腦組織染成紅色,缺血區呈灰白色。TTC 染色均勻後取出腦組織,放置於盛有4%多聚甲醛液的小瓶內,固定24 h,取出後濾紙吸乾表面水分,用掃描器掃出圖片,計算梗死體積佔大腦半球體積的百分比。
2.3.3 大鼠腦組織及微血管的形態觀察
造模後第7 日,大鼠灌注後斷頭取腦,置於4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液***pH 7.2～7.6***固定24 h 後,常規脫水、透明、浸蠟、包埋,於視交叉前緣開始作5 m 厚冠狀切片。常規脫蠟水化,行HE 染色,中性樹膠封片。光鏡下觀察腦組織及微血管形態學改變。
2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及腦組織中基
質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9、血管內皮生長因子的含量測定 造模後第7 日,將動物麻醉,自腹主動脈採血,靜置30 min 後離心取上清凍存備用。再取腦分離出左側***患側***半球放於凍存管置液氮中,檢測前以生理鹽水製成10%腦組織勻漿。取製備好的血清及腦組織勻漿,按照試劑盒說明操作。
3 統計學方法
採用SPSS17.0 統計軟體進行分析。實驗結果均以xs 表示,資料資料經正態性分佈檢驗及方差齊性檢驗後,採用方差或非引數檢驗比較組間差異。P 0.05 表示差異有統計意義。
4 結果
4.1 補陽還五湯對大鼠神經功能評分的影響
動物甦醒後,模型組和補陽還五湯組都存在明顯神經功能缺損,神經功能評分差異無統計學意義***P 假手術組未見神經功能缺損。灌胃6 d 後,模型組神經功能評分略增高,但前後比較差異無統計學意義***P 補陽還五湯組神經功能評分顯著降低,與模型組比較差異有統計學意義*** P 0.01***,提示補陽還五湯能夠促進大鼠的神經功能恢復,減輕缺損程度。各組大鼠神經功能評分。
4.2 補陽還五湯對大鼠腦梗死體積的影響
TTC 染色結果表明,假手術組腦片均紅染,無白色梗死灶形成。模型組大鼠梗死灶位於缺血側腦組織基底節區和額頂部外側皮層,腦梗死灶明顯。補陽還五湯組腦梗死體積顯著減小,與模型組比較差異有統計學意義***P 0.05***。
4.3 病理觀察結果
假手術組大鼠腦組織結構完整,灰白質邊界清楚,皮質各層細胞分佈基本正常;神經元排列整齊且形態多樣,胞核較大、居中、著色淺、核仁清晰、胞質深染;腦微血管內皮細胞結構完整、連線緊密,未見炎細胞浸潤、充血及水腫。模型組腦組織可見梗死灶,灶內結構疏鬆,呈水腫樣,神經元丟失明顯,殘存的神經元細胞核固縮、濃染;腦微血管內皮細胞受損,可見炎細胞浸潤,嵌塞。補陽還五湯組腦組織病理變化較模型組減輕,梗死灶體積較模型組縮小,水腫情況減輕;存活的神經元數目有所增加,血管內皮細胞受損較模型組減輕,有少量炎性細胞浸潤;半暗區損傷亦有所改善。
4.4 補陽還五湯對大鼠血清中血管性血友病因子及腦組織中基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9、血管內皮生長因子含量的影響
與假手術組比較,模型組VEGF、MMP-2、MMP-9 及vWF 含量顯著增加***P 0.01,P 與模型組比較,補陽還五湯組VEGF、vWF、MMP-9 及MMP-2 含量顯著降低***P 0.01,P 0.001***。提示腦缺血7 d 後,模型組腦組織中VEGF、MMP-2、MMP-9 及血清中vWF 均增高,補陽還五湯能阻抑其表達。
5 討論
現代研究表明,補陽還五湯可增強微血管應激能力,緩解微血管痙攣,減輕其損傷程度,使微血管密度及微血管面積比增加,減輕缺血損傷。本實驗結果表明,給永久性腦缺血動物補陽還五湯後,神經功能缺損明顯改善,腦梗死體積顯著減小。血腦屏障破壞可導致血管源性腦水腫和腦疝的發生,造成病情的惡化。
故減輕缺血對血腦屏障造成的損傷,保護腦組織,成為治療的一個重要靶點。腦組織中細胞外基質***ECM***是維持血腦屏障結構完整性的重要組成部分,而MMPs 啟用後能夠降解ECM 成分。MMPs 是一組Zn2+、Ca2+依賴性的蛋白水解酶,正常時以酶原形式存在,在一些生理和病理條件下被啟用,參與組織的損傷和修復。在腦缺血損傷中起重要作用的是MMP-2 和MMP-9,可降解ECM、破壞腦血管外基底膜主要成分,從而破壞血腦屏障、改變毛細血管通透性導致血管源性腦水腫甚至出血性轉化,還可使炎性細胞浸潤至腦組織,引發一系列炎症反應。腦缺血後MMP-2 表達增加與早期神經元的損傷有關,MMP-9 表達增加與腦梗死後出血轉化有關。MMP-9 水平的上升出現在缺血性腦卒中早期或急性期,導致血腦屏障的破壞,進一步促使神經炎症反應和神經細胞的繼發性死亡。Higashida J 等研究發現,通過提高缺氧誘導因子-1***HIF-1***、水通道蛋白4***AQP4***、MMP-9 的表達可以降低血管基底膜蛋白表達和緊密連線蛋白的表達,加重腦水腫,通過抑制HIF-1、MMP-9 的表達,降低血腦屏障的通透性,但不受AQP4 的影響。Romanic 等[6]則發現應用MMP-9 單克隆抗體,梗死灶縮小了29.9%。因此我們推測,早期選擇性抑制MMP-2、MMP-9 可顯著減輕腦梗死。
本實驗採用酶聯免疫法檢測了腦組織中MMP-2、MMP-9 蛋白表達情況,在假手術組僅有少量表達,與文獻報道基本一致[9-10],腦缺血後MMP-2、MMP-9 蛋白表達量顯著增加,應用補陽還五湯干預後,二者水平均顯著下降,提示補陽還五湯可以通過抑制MMP-2、MMP-9 表達,保護血腦屏障,減輕腦損傷。內皮細胞是構成血腦屏障的主要物質基礎。迴圈中的vWF 主要來自血管內皮細胞,內皮細胞受損則合成和釋放vWF 增加,內皮細胞損傷越嚴重,則血漿中vWF 水平越高。vWF 可加速血小板黏附、聚集,介導血小板釋放相關因子,干擾纖溶過程,促進血管平滑纖維化、動脈粥樣斑塊及血栓形成,且與疾病的輕重呈正相關。因此,vWF 被認為是心血管疾病的一個高危因素,並被作為血管內皮細胞損害的標誌物。本實驗腦缺血後大鼠血清中vWF 表達增高,補陽還五湯顯著減少了其表達,說明補陽還五湯可以保護內皮細胞,從而維持血腦屏障結構的完整性。
VEGF 是另一種特異性作用於血管內皮細胞的多功能因子,是內皮細胞特異性的促有絲分裂源,能促進內皮細胞分裂、增殖增生和轉移,它在血管生成的各個階段均發揮著重要作用,是目前公認的血管新生中最關鍵的因子。本實驗假手術組VEGF 有少量表達,模型組VEGF 表達量增高,這可能是缺血性腦損傷誘導VEGF 基因早期表達的緣故;應用補陽還五湯干預後,VEGF 顯著降低,筆者認為,這可能和VEGF 的動態表達有關。因此,可以推測,補陽還五湯可通過多環節調節VEGF,保護血腦屏障。
目前,西醫治療腦缺血及其後遺症尚無突破性進展,而中醫藥防治腦缺血具有很大潛力。本實驗顯示,補陽還五湯能改善神經功能缺損,減少腦梗死體積,其發揮作用的機理可能是通過抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表達而保護血腦屏障,也可能是通過調控VEGF、vWF等內皮活性因子,改善微迴圈,促進腦血流的恢復。
談不同比例士的寧對馬錢子鹼體外經皮滲透性質的影響
馬錢子又名番木鱉，為馬錢科馬錢屬植物馬錢***Strychnosnux-vomica L.***或雲南馬錢***S.pierriana A.W. Hill***的乾燥成熟種子，主要有效成分為生物鹼類。包括士的寧、馬錢子鹼、士的寧氮氧化物、馬錢子鹼氮氧化物、異馬錢子鹼、偽馬錢子鹼等，約佔總量1%-5%。其中士的寧和馬錢子鹼約佔總生物鹼的70%。馬錢子生物鹼作用於免疫、神經、心血管等系統，具有抗炎及免疫、鎮痛、抗腫瘤等顯著療效。主要有效成分馬錢子鹼具有很強的抗炎鎮痛和關節炎滑膜細胞增殖抑制作用，而士的寧在抗炎鎮痛方面活性較差，且毒性較強，其口服中毒量是馬錢子鹼的1/71。因此馬錢子製劑中士的寧的含量會直接影響製劑的藥效及毒性。
研究表明，馬錢子製成經皮給藥製劑對風溼痺症等具有較好療效，但其毒性，尤其是士的寧是亟待解決的問題之一。為達到治療的增效減毒，本實驗利用體外經皮擴散方法，探討士的寧與馬錢子鹼在不同比例下，馬錢子鹼的經皮擴散行為，為馬錢子的炮製及其經皮製劑的研究等應用方面提供參考依據。
材料
1. 動物
清潔級雄性ICR小鼠30只，體質量***20.03.0***g，浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK***浙***2008-0033。
2. 儀器
1200 Agilent高效液相色譜***美國Agilent公司***;RYJ-12B藥物透皮擴散試驗儀***上海黃海藥檢儀器有限公司***;XS205電子微量天平***瑞士Mettler Toledo公司***;STARTER2100酸度計***美國OHAUS公司***。
3. 試藥
馬錢子鹼對照品***中國藥品生物製品檢定所，批號：110706-200505，純度95.9%***;士的寧對照品***中國藥品生物製品檢定所，批號：110705-200306，純度97%***;馬錢子鹼純品***南京澤朗植提技術有限公司，批號：ZL110116，純度97.2%***;士的寧純品***南京澤朗植提技術有限公司，批號：ZL110120，純度96.2%***;馬錢子購於杭州華東中藥飲片有限公司，批號：101011，經該公司質檢科鄭霄鷹主管藥師鑑定為馬錢科植物馬錢子***Strychnos nux-vomica.L.***的乾燥成熟種子;馬錢子總生物鹼提取物1***自制，批號：20120608，馬錢子鹼含量94.1%***;馬錢子總生物鹼提取物2***自制，批號：20120828，馬錢子鹼含量27.01%，士的寧含量2 6 .95%，總生物鹼含量67.38%***。乙腈***美國Tedia公司，批號：14035045，色譜純***;其他試劑均為分析純。
方法
1. 透皮接受液中馬錢子鹼、士的寧的含量測定方法研究
1.1 色譜條件
色譜柱：Agilent SB-C18柱***4.6mm150mm，5流動相：乙腈-0.01moL/L庚烷磺酸鈉與0.02moL/L磷酸二氫鉀等量混合***10%磷酸調pH值為2.80******21∶79***;流速：1.0mL/min;檢測波長：260nm;進樣量：20柱溫：室溫。
1.2 對照品溶液的製備
精密稱量馬錢子鹼、士的寧對照品適量，甲醇溶解，流動相稀釋至濃度分別為38.80、45.20g/mL。
1.3 供試品溶液的製備
取透皮接受液，0.45m微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。
1.4 標準曲線
取1.2項下對照品溶液，分別進樣5、10、15、20、30、40、50、60L，在上述色譜條件下進行檢測。相應對照品峰面積***Y***為縱座標，進樣量***X***為橫座標進行線性迴歸，得到馬錢子鹼迴歸方程Y=1 767.7X-39 093，r=0.9999，馬錢子鹼在0.194-2.328g內線性關係良好。得到士的寧迴歸方程Y=2 352.3X-2 9943，r=0.9929，士的寧在0.226-2.712g內線性關係良好。
1.5 儀器精密度試驗
精密吸取對照品溶液，連續進樣6次，計算峰面積的RSD值分別為0.19%，0.18%，說明儀器精密度良好。
1.6 重複性試驗
平行製備供試品溶液6份，進樣檢測，計算馬錢子鹼和士的寧的RSD值均為0.32%。說明此方法的重複性良好。
1.7 加樣回收率試驗
精密量取已知含量馬錢子鹼18.79g/mL，士的寧3.57g /mL的上述供試品溶液6份，每份0.5mL，各加0.2mL混合對照品溶液，流動相定容至2mL，在上述色譜條件下進行檢測，計算回收率，結果見表1。測得馬錢子鹼和士的寧的平均回收率為96.74%，99.28%，RSD值分別為0.99%，0.55%***n=6***。說明此方法準確度良好。
1.8 樣品溶液穩定性試驗
取上述供試品溶液置於37℃條件下***n=6***，24h後測定含量，馬錢子鹼、士的寧的RSD值分別為1.17%和1.52%，表明在37℃條件下透皮接受液中馬錢子鹼和士的寧在24h內穩定性良好。
2. 體外經皮吸收實驗
2.1 接受介質的配製
稱取氯化鈉8.00g，氯化鉀0.20g，磷酸氫二鈉3.63g，磷酸二氫鉀0.2 4g，加蒸餾水溶解定容至1 0 0 0mL，即得pH值7.40磷酸鹽緩衝液***PBS***。量取80 0mLPBS加入200mL無水乙醇，混勻，即得20%乙醇的PBS溶液。
2.2 樣品溶液的配製
馬錢子鹼溶液的配製：精密稱取馬錢子鹼純品適量，接受介質溶解稀釋至濃度為1.56mg/mL。士的寧溶液的配製：精密稱取士的寧純品適量，接受介質溶解稀釋至濃度為0.48mg/mL。馬錢子總生物鹼提取物1溶液的配製：精密稱取馬錢子總生物鹼提取物1適量，接受介質溶解稀釋至馬錢子鹼濃度為1.62mg/mL。馬錢子總生物鹼提取物2溶液的配製：精密稱取馬錢子總生物鹼提取物適量，接受介質溶解稀釋至馬錢子鹼濃度為0.829mg/mL，士的寧濃度為0.797mg/mL。按一定比例吸取上述馬錢子鹼、士的寧溶液，製得不同比例的純品組;馬錢子總生物鹼提取物1溶液中加入適量馬錢子總生物鹼提取物2溶液，製得不同比例的提取物組。
2.3 離體面板的製備
取雄性健康小鼠，用7%硫化鈉溶液***含5%甘油***活體脫去其背部毛髮後0.9%氯化鈉溶液洗淨面板，擦乾後飼養12h。處死後剝離背部面板，剔除皮下脂肪和黏連物，0.9%氯化鈉溶液洗淨，待用。
2.4 離體透皮實驗
將小鼠面板自然固定在改良的Franz擴散池兩室之間，面板角質層朝向供藥室，有效擴散面積為2.8cm2，接受室容積為6.5mL。接受室中加入37℃預熱的接受介質，面板與接受液間緊密貼合，排盡氣泡。供藥室中分別加入0.5mL上述比例的純品組和提取物組溶液，***37.01.0***℃恆溫水浴加熱，以600r/min磁力恆速攪拌。分別於給藥後2、4、6、8、10、12、24h取樣5mL，並補加5mL 37℃預熱的新鮮接受介質。HPLC法測定馬錢子鹼，士的寧含量。根據各取樣點接受液中馬錢子鹼，士的寧含量，計算單位面積藥物累積透過量***Q***及穩態滲透速率***J***。Q計算公式如下：Q=***V0Cn+Vn-1i-1Ci***/A ***1***其中Q為單位面積累積透過量***A為有效透皮吸收面積***cm2***;V0為接受液體積***mL***;V為取樣體積***mL***;Ci、Cn為第i***in-1***、n個取樣點測得接受液中藥物濃度***g/mL***。並按公式***2***計算累計透過百分率Q%。Q%=QA/QT ***2***其中QT為上樣的總藥量***g***。
結果
1. 馬錢子鹼的透皮結果
馬錢子鹼在純品組及提取物組中透皮累積滲透曲線。透皮速率及累積透過百分率。隨著士的寧比例的增加，純品組及提取物中組馬錢子鹼的J及Q%依次減小。當比例為1∶0.6，提取物組與純品組進行比較，Q%明顯升高***P0.05***，J增大，說明可能其他生物鹼的存在對馬錢子鹼的透過有一定的影響。
2 . 士的寧的透皮結果
士的寧在純品組及提取物組中透皮累積滲透曲線。透皮速率及累積透過百分率。
討論
本研究發現：隨著士的寧比例的增大，士的寧的J與Q%逐漸升高，而馬錢子鹼的J與Q%隨之降低。說明提取物或混合物中士的寧均可抑制馬錢子鹼的透皮吸收效能，且隨著士的寧比例的增大抑制效果增強，這與胡巍等[13]報道的結果有所出入。由馬錢子鹼和士的寧的結構式可知：其結構和物理化學性質相似，透皮吸收時產生同質競爭抑制是有可能的。但是，不同實驗動物乃至人體面板的實驗結果是否也類似，以及具體機制等均需通過進一步實驗研究加以確證。此外，研究結果還表明：馬錢子總生物鹼提取物中其他生物鹼等能夠促進士的寧的透皮吸收。由此證明，馬錢子生物鹼用於類風溼關節炎治療時，儘可能降低士的寧的含量，對增效減毒具有重要意義。馬錢子治療類風溼性關節炎效果顯著，但由於毒性較強極大限制臨床應用。本研究的發現可為馬錢子的炮製和經皮給藥製劑研究應用等方面提供依據參考。