細胞凋亡學說在帕金森病發病機制的理論探索

【關鍵詞】  帕金森病;發病機制;細胞凋亡

帕金森病***PD***主要症狀包括靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等，病理變化主要為黑質緻密部***DSN***和多巴胺***DA***能神經元選擇性變性〔1〕。PD病情呈漸進性的加重過程，患者晚期生活無法自理，最終死於肺部感染等併發症。PD 在中老年人群發病率很高，流行病學調查顯示〔2〕，55 歲以上人口 PD 患病率為 1.4%，在 75 歲以上人口達 3.4%。PD 被發現以來其病因到目前仍不明確，有關病因的假說主要有遺傳學說和環境毒素學說。隨著研究水平的提高，從細胞凋亡理論探索PD的發病機制近幾年受到了國內外學術界的關注。

　　1 PD研究中已克隆出的相關基因與細胞凋亡〔3〕

　　見表1。這些基因的發現能夠解釋家族性 PD 的病因，但家族性PD佔PD病人的總數還不到10%，其餘的大部分都是散發性PD，很難確定其中的遺傳因素。環境毒素學說的提出最早開始於1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氫吡啶***1?methyl?4? phenyl?1，2,3,6?tetrahydropyridine，MPTP***毒性作用的發現〔4〕。人類和非靈長類動物給予MPTP後引起PD的運動缺乏表現，並且伴隨著有DSN、DA 能神經元的選擇性破壞和DA含量的顯著降低。另外，除草劑和殺蟲劑的使用與PD的發生呈正相關。魚藤酮是一種被廣泛應用的殺蟲劑，能夠抑制線粒體複合體Ⅰ的活性。在動物實驗中發現，靜脈注射魚藤酮可以選擇性造成DA能神經元的死亡，殘存神經元內形成一種被稱為Lewy小體的物質，並且動物出現類似PD運動障礙的症狀〔5〕。這都表明在散發型PD的發病過程中環境因素可能起著重要的作用。雖然遺傳學說和環境毒素學說都各有依據，但彼此不能互相否定。許多遺傳學的研究不能排除親緣關係較近的人群受共同生活環境的影響;而環境毒素學說也不能解釋為什麼接觸毒素後僅有少數人出現了PD症狀。這就產生了另外一個假說，即大部分PD是在一定的遺傳背景下受環境毒素侵害而發病的，但這一學說有待於相關研究的證實。

　　PD的發病機制尚未明確。目前有關PD發病機制的假說有氧化應激、線粒體損傷、神經興奮毒性、神經營養缺失、蛋白水解應激、免疫異常、炎症反應、多巴胺轉運體失活、α?synuclein異常沉積和細胞凋亡等，其中神經興奮毒性、氧化應激和細胞凋亡學說較受重視〔6〕。神經興奮毒性學說認為興奮型神經遞質如穀氨酸***Glu***等大量釋放，通過激動α?氨基羥甲惡唑丙酸***AMPA***受體及N?甲基D天門冬酸***NMPA***受體和代謝型Glu受體以及通過膜去極化啟用電壓依賴性鈣通道造成胞內鈣超載，最終通過一系列機制導致細胞死亡。氧化應激學說認為PD是由於神經細胞氧化磷酸化過程中所產生的自由基過多或自由基清除功能減弱導致過多的氧自由基攻擊某些關鍵酶、生物膜類脂和DNA，最終導致細胞死亡。PD的發病因素如氧化應激、抗氧化功能缺失和線粒體功能損傷等均可在不同水平誘導神經細胞凋亡〔1〕。

　　表1 已克隆的PD相關基因

　　基因名稱遺傳方式基因位點染色體位點α?synuclein顯性遺傳PARK1***28***4q21?q23Parkin隱性遺傳PARK2***58***6q25.2?27未命名顯性遺傳PARK3***74***2p13α?synuclein顯性遺傳PARK4***30，31***4qUchL1顯性遺傳PARK5***59***4p14未命名隱性遺傳PARK6***75***1p35?p36DJ?1隱性遺傳PARK7***76***1p36未命名顯性遺傳PARK8***77***12p11q13.1未命名隱性遺傳PARK9***78***1p36未命名遲發易患基因PARK10***79***1p32NR4A2易患基因NA***80***2q22?23Synphilin?1易患基因NA***81***5q23.1?23.3Tau易患基因NA***40***17q21

　　細胞凋亡又稱程式性細胞死亡***PCD***，它是上世紀70年代提出的一種不同於壞死的細胞死亡方式，是有核細胞在一定條件下通過啟動自身內部機制，即主要通過內源性DNA內切酶的啟用而發生的細胞自然死亡過程，維持組織細胞內環境穩態、將一些多餘細胞清除的必不可少機制〔7〕。然而，PCD也是一種病理現象，如在神經退行性疾病中發現有大量的神經元發生凋亡〔1,2〕。PCD是受基因調控的主動的細胞自殺現象，調控PCD的基因有：p53基因、Bcl?2基因家族、c?myc基因和survivin基因等。關於PCD過程中訊號轉導系統，目前認為主要通路有兩條：膜受體通路和線粒體通路。這兩條通路的下游途徑都是通過啟用caspase級聯反應，最終導致細胞死亡〔8〕。

　　2 PD 神經元凋亡的主要誘發因素〔9〕

　　目前大量的研究表明氧化應激可能在 PD 的發生、神經細胞最終凋亡中發揮重要作用。自由基的生成主要有以下幾個方面：①過氧化氫***H2O2***是DA代謝過程中產生的正常代謝副產物。酪氨權羥化酶***TH***催化生成 DA 和單胺氧化酶***MAO?B***降解DA時都有H2O2的生成，DA自身氧化也可產生少量的H2O2，H2O2分解產生·OH。這個過程在鐵存在時加速，尤其是Fe2+，用反應式表示為：Fe2++H2O2→Fe3++OH?+·OH，即Fenton反應。在PD患者腦中發現了鐵水平的異常升高，而結合Fe2+的鐵蛋白的水平則下降。②外源性神經毒素如 MPTP，經膠質細胞內 MAO?B 酶氧化還原形成 MPP+，MPP+經DA轉運體攝取至DA神經元內，MPP+抑制線粒體複合體Ⅰ導致呼吸鏈產生大量的自由基，從而造成對細胞內生物大分子的損傷，導致神經元死亡。③自由基的另一個來源為大腦黑質病變時，一氧化氮合成酶 ***NOS*** 的表達增加導致一氧化氮***NO***和過氧硝酸鹽自由基水平升高。另外，小膠質細胞的啟用可增加活性氧簇***ROS***的釋放。正常情況下體內有完整的自由基清除體系，包括Vitmain A,C,E,微量元素Se,Zn,Mn和內源性物質包括谷胱甘肽***GSH***、過氧化物歧化酶***SOD***、輔酶Q、NADPH、褪黑素以及尿素等。但在PD患者黑質中發現GSH和總谷胱甘肽***GSH+GSSG***水平降低。Nakamura等〔10〕發現GSH的降低使DA能神經元對MPP+的神經毒效應增敏。使用自由基清除劑可使包括MPP+在內的複合體Ⅰ抑制劑誘導的PCD減少，說明了複合體Ⅰ抑制後產生凋亡的過程包含自由基的生成。在PD患者屍檢研究發現〔11〕，患者黑質中脂質過氧化物水平明顯升高。因此，導致氧化應激的各種因素的協同作用，包括線粒體功能障礙、DA能代謝產物的增加、鐵含量增加以及GSH的耗竭等，可誘發DA能神經元的變性和壞死。

　　3 PD 神經元凋亡的關鍵事件

　　線粒體是細胞的一個獨特而重要的細胞器，細胞內氧化磷酸化、能量代謝和抗氧化作用都有賴於線粒體功能的發揮。線粒體亦是PCD調控中心。在凋亡早期，細胞形態改變之前，最早表現為線粒體跨膜電位下降。跨膜電位是線粒體維持正常功能的必備條件。跨膜電位下降後，線粒體膜的滲透性發生改變，引起線粒體腫脹，線粒體膜上的孔或通道增大，使線粒體內的物質外流。細胞色素C從線粒體釋放是PCD的關鍵步驟。釋放到胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與Apaf?1結合，使其形成多聚體，並促使caspase?9酶原與其結合形成凋亡體，caspase?9酶原被自我活化，活化的caspase?9能啟用其他的caspase如caspase?3等，caspase?3水解其底物，從而誘導PCD。在PD患者中可檢測到線粒體功能障礙，主要是線粒體複合體Ⅰ受損。複合體Ⅰ位於線粒體內膜，為生成ATP的氧化磷酸化系統的一部分。線粒體功能障礙的原因至今不明，有人認為是編碼氧化磷酸化系統某些蛋白的基因發生了突變〔12〕。另外，研究發現〔1〕MPTP和其他外源性殺蟲劑也可以損傷線粒體複合體Ⅰ的功能。無論如何，線粒體功能障礙都可導致ATP水平的降低，誘發自由基生成，最終使神經元凋亡。

4 PD神經元凋亡的基因調控〔13〕

　　①bcl?2家族，Ziv等用PC12細胞系研究發現bcl?2能明顯抑制DA氧化產物的生成,並且能阻止細胞內GSH水平下降。Hassouna等發現小鼠經腹膜注射MPTP後，其腦內黑質區bax mRNA合成增加，注藥後3 d和6 d分別達到正常的2倍和3倍，在黑質區呈現相應bax免疫反應性的大、中型神經元都發生了壞死。說明MPTP可誘發bax表達,促進凋亡的發生。②p53，p53啟用可介導DA誘導細胞凋亡。③c?jun、c?fos轉錄因子c?jun、c?fos被認為在神經細胞凋亡誘導中發揮著重要作用。但在多種PCD過程中確實存在c?fos的過度表達，但到底是c?fos引起PCD還是PCD同時伴有c?fos的增多，到目前為止還沒有確證。④caspase中腦黑質DA能神經元的缺失是PD的主要病理特點。檢測PD患者死亡後腦組織時發現，中腦多巴胺能神經元的丟失與Caspase?3陽性神經元呈正相關。在MPTP誘導的小鼠PD模型中，Caspase?3的啟用在第1、2天即達高峰，但是到第7天時DA能神經元的丟失才會很明顯,說明Caspase的啟用是DA能神經元凋亡過程的早期訊號。Caspase?3是PD患者和PD動物模型黑質DA能神經元凋亡的易感因子和效應器〔14〕。

　　綜上所述，PCD作為PD的發病機制學說之一，在一定程度上被研究者證實，但人們對於PD病人腦內的DA能神經元是否發生凋亡依然存在爭論，這主要有三方面的原因：①PD的病程較長，同一時間內發生退變的神經元數量很少，而典型的PCD形態也只能保持幾天，所以在任何一個時間點去觀察都很難找到凋亡的形態學證據;②屍檢的標本多來自於晚期PD病人，此時病變的DA能神經元大都已經缺失，難以檢測;③判定凋亡的標準過於單一，多數的研究僅採用形態學標準，而單一的形態學方法無法準確區分凋亡與壞死。最常用來檢測DA能神經元凋亡的方法為TUNEL法，目前認為單純使用TUNEL法檢測病人腦組織所取得的結果可信度很低，例如氧化應激導致細胞壞死的同時也有DNA的斷裂，TUNEL檢測為假陽性;處於有絲分裂期的膠質細胞可以被d?UTP標記，導致假陽性結果;死後的腦組織如果不能被及時固定會增加非特異性標記，呈假陽性結果，如果固定時間過長引起蛋白質交聯則呈假陰性結果;Ca2+和 Mg2+等二價陽離子可以提高d?UTP與DNA 3′末端的親合力，微小的濃度變化對結果有較大的影響;核酸內切酶的種類較多，作用於DNA產生各種不同的形狀的殘端，而末端脫氧核酸轉移酶與不同的DNA殘端結合能力差別較大，使結果變得不穩定。

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