關於生物科學論文

　　21世紀被稱為“生物技術世紀”。下面是小編為大家精心推薦的，希望能夠對您有所幫助。

　　篇一

　　生物晶片研究進展

　　摘要　生物晶片是行動式生物化學 分析 器的核心技術。通過對微加工獲得的微米結構作生物化學處理能使成千上萬個與生命相關的資訊整合在一塊釐米見方的晶片上。採用生物晶片可進行生命 科學 和醫學中所涉及的各種生物化學反應，從而達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。生物晶片 發展 的最終目標是將從樣品製備、化學反應到檢測的整個生化分析過程整合化以獲得所謂的微型全分析系統***micro total analytical system***或稱縮微晶片實驗室***laboratory on a chip***。生物晶片技術的出現將會給生命科學、醫學、化學、新藥開發、生物武器戰爭、司法鑑定、食品和環境衛生監督等領域帶來一場革命。本文闡述了生物晶片技術在加工製備、功能和 應用 方面的近期 研究 進展。

　　關鍵詞：生物晶片，縮微晶片實驗室，疾病診斷，基因表達

　　人類基因組計劃的目標是在2005年完成對30億個人體基因組DNA鹼基的序列測定，現在通過使用更高階的毛細管陣列測序儀和商業操作，使該計劃有望提前完成。因此，人們現已開始利用人類基因組計劃中所發現的已知基因對其功能進行研究，亦即把已知基因的序列與功能聯絡在一起的功能基因組學研究。另外，與疾病相關的研究已從研究疾病的起因向探索發病機理方面轉移，並從疾病診斷向疾病易感性研究轉移。由於所有上述這些研究都與DNA結構、病理和生理等因素密切相關，因此許多國家現已開始考慮在後基因組時期，研究人員是否能用有效的硬體技術來對如此龐大的DNA資訊以及蛋白質資訊加以利用。為此，先後已有多種解決方案問世，如DNA的質譜分析法[1]、熒光單分子分析法[2]、陣列式毛細管電泳[3]、雜交分析[4]等。但到 目前 為止，在對DNA和蛋白質進行分析的各種技術中，發展最快和應用前景最好看的技術當數以生物晶片技術為基礎的親和結合分析、毛細管電泳分析法[5]和質譜分析法。此外，在此基礎上，通過與採用生物晶片技術和樣品製備 方法 ***晶片細胞分離技術[6]和生化反應方法***如晶片免疫分析[7]和晶片核酸擴增[8]***相結合，許多研究機構和 工業 界都已開始構建所謂的縮微晶片實驗室。建立縮微晶片實驗室的最終目的是將生命科學研究中的許多不連續的分析過程，如樣品製備，化學反應和分離檢測等，通過採用象積體電路製作過程中的半導體光刻加工那樣的縮微技術，將其移植到晶片中並使其連續化和微型化。這些當年將數間房屋大小的分離元件 計算 機縮微成現在只有書本大小的筆記本式計算機有異曲同工之效。用這些生物晶片所製作的具有不同用途的生化分析儀具有下述一些主要優點，即分析全過程自動化、生產成本低、防汙染***晶片系一次性使用***、分析速度可獲得成千上萬倍的提高、同時，所需樣品及化學藥品的量可獲得成百上千倍的減少、極高的多樣品處理能力、儀器體積小、重量輕、便於攜帶。這類儀器的出現將會給生命科學、醫學、化學、新藥開發、生物武器戰爭、司法鑑定、食品和環境衛生監督等領域帶來一場革命。因此，它已廣為各國學術界和工業界所矚目[9]。

　　1 生物晶片的微加工製備

　　生物晶片的加工借用的是微 電子 工業和其他加工工業中比較成熟的一些微細加工***microfabrication***工藝***如：光學掩模光刻技術、反應離子刻蝕、微注入模塑和聚合膜澆注法***，在玻璃、塑料、矽片等基底材料上加工出用於生物樣品分離、反應的微米尺寸的微結構，如過濾器、反應室、微泵、微閥門等微結構。然後在微結構上施加必要的表面化學處理，再在微結構上進行所需的生物化學反應和分析。

　　生物晶片中目前發展最快的要算親和結合晶片***包括DNA和蛋白質微陣列晶片***。它的加工除了用到一些微加工工藝以外，還需要使用機器人技術。現在有四種比較典型的親和結合晶片加工方法。一種是Affymetrix公司開發出的光學光刻法與光化學合成法相結合的光引導原位合成法[10]。第二種方法是Incyte pharmaceutical公司所採用的化學噴射法，它的原理是將事先合成好的寡核苷酸探針噴射到晶片上指定的位置來製作DNA晶片的。第三種是斯坦福大學所使用的接觸式點塗法。該方法的實現是通過使用高速精密機械手所帶的移液頭與玻璃晶片表面接觸而將探針定位點滴到晶片上的[11]。第四種方法是通過使用四支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴頭在晶片上作原位DNA探針合成的[12]。

　　2 生物晶片舉例

　　生物晶片是縮小了的生物化學分析器，通過晶片上微加工獲得的微米結構和生物化學處理結合，便可將成千上萬個與生命相關的資訊整合在一塊釐米見方的晶片上。採用晶片可進行生命科學和醫學中所涉及的各種生物化學反應，以達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。通過分析可得到大量具有生物學、醫學意義的資訊。生物化學反應和分析過程通常包括三個步驟：1，樣品製備;2，生物化學反應;3，檢測和資料分析處理。將其中一個步驟或幾個步驟微型化整合到一塊晶片上就能獲得具有特殊功能的生物晶片，例如用於樣品製備的細胞過濾器晶片和介電電泳晶片、用於基因突變檢測和基因表達的DNA微陣列晶片和用於藥物篩選的高通量微米反應池晶片等。現在，世界各國的科學家們正致力於將生化分析的全過程通過不同晶片的使用最後達到全部功能的整合，以實現所謂的微型全分析系統或縮微晶片實驗室。使用縮微晶片實驗室，人們可以在一個封閉的系統內以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。

　　2.1 樣品製備晶片

　　針對DNA分析，其製備過程通常要經過細胞分離、破胞、脫蛋白等多方面的工作，最後得到純度足夠高的待檢DNA。目前在細胞分離方法上較突出的有過濾分離***根據生物顆粒的尺寸差異進行分離***和介電電泳分離***利用在晶片上所施加的高頻非均勻電場使不同的細胞內誘匯出偶電極，導致細胞受不同的介電力作用，而從樣品中分離出來***等;晶片中的破胞方法有晶片升溫破胞、變壓脈衝破胞，以及化學破胞等。在捕獲DNA方面，CephEid公司應用溼法蝕刻和反應離子蝕刻/等離子蝕刻等工藝在矽片上加工出含有5000個高200微米直徑20微米的具有細柱式結構的DNA萃取晶片，專門用於DNA的萃取[13]。

　　2.2 生物化學反應晶片

　　由於目前所用檢測儀器的靈敏度還不夠高，因此從樣品中提取的DNA在標記和應用前仍需用PCR這樣的擴增複製技術複製幾十萬乃至上百萬個相同的DNA片段。

　　目前，在晶片中進行核酸擴增反應獲得成功的有賓夕法尼亞大學研究小組[8，14]，美國勞倫斯-利物摩國家實驗室[15]和Perkin-Elmer公司[16]。賓夕法尼亞大學研究小組所做的擴增反應都是在矽-玻璃晶片中進行的，晶片的外部加熱和冷卻採用的是計算機控制的帕爾帖電-熱器。在對晶片表面進行惰性處理後，亦即在矽片表面生長一層2000埃的氧化矽之後，他們成功地在矽-玻璃晶片中完成了一系列不同的核酸擴增反應，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由勞倫斯-利物摩國家實驗室加工的矽晶片所採用的加熱方式是晶片內建的薄膜多晶矽加熱套，其升降溫的速度很快。Perkin-Elmer公司的PCR反應則是在塑料晶片上完成的。倫敦帝國理工大學的研究者研製了一種樣品可在不同溫度的恆溫區間內連續流動的PCR晶片[17]。上述所有工作都是用事先提純了的DNA或RNA作為擴增反應的底物來完成的。為了將樣品製備和擴增反應整合為一體，賓夕法尼亞大學研究小組最近成功地在壩式微過濾晶片中直接對分離所得的人白細胞通過升溫方式胞解後所釋放的DNA進行了擴增，這是世界上首例將樣品製備和擴增反應整合為一體的研究成果[14]。

　　2.3 檢測晶片

　　2.3.1 毛細管電泳晶片

　　晶片毛細管電泳是1983年由杜邦公司的Pace開發出來的[18]。隨後，瑞士的Ciba-GEIgy公司和加拿大的Alberta大學合作利用玻璃晶片毛細管電泳完成了對寡核苷酸的分離[19]。首次用晶片毛陣列電泳檢測DNA突變和對DNA進行測序的是由加利福尼亞大學伯格利分校Mathies領導的研究小組完成的[20,21]。通過在晶片上加上高壓直流電，他們在近兩分鐘的時間內便完成了從118bp到1353bp的許多DNA片段的快速分離。此外，Mathies的小組與勞倫斯-利物摩國家實驗室Nothrup的研究小組合作，報道了首例將核酸擴增反應與晶片毛細管電泳整合為一體所作的多重PCR檢測工作[22]。賓夕法尼亞大學Wilding的小組與Ramsey的小組一道用晶片毛細管電泳對晶片中擴增得到的用於杜鑫-貝克肌萎縮診斷的多條DNA片段進行分離也獲得了成功[14]。其他用 晶片毛細管電泳檢測突變的外國公司和學術機構有Perkin-Elmer公司、Caliper technologies公司、Aclara biosciences公司和麻省理工等。

　　2.3.2 DNA突變檢測晶片

　　dNA之所以能進行雜交是因為核苷A和T、G和C可同時以氫鍵結合互補成對。許多經典的分子生物學方法如桑格DNA測序法和PCR等都是以此為基礎的。最近出現的幾項技術，如用光刻掩膜技術作光引導原位DNA合成[23]、電子雜交技術[24]、高靈敏度鐳射掃描熒光檢測技術[25]等，使以雜交為基礎的應用有了長足的改善。最近的一些 英文 權威刊物對應用晶片雜交技術檢測突變作了報道。Hacia等人採用由96000個寡核苷酸探針所組成的雜交晶片，完成了對遺傳性乳腺癌和卵巢腫瘤基因BRCA1中外顯子上的24個異合突變***單核苷突變多型性***的檢測。他們通過引入參照訊號和被檢測訊號之間的色差分析使得雜交的特異性和檢測靈敏度獲得了提高[26]。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探針晶片對HIV病株的多型性作了分析[27]。Cronin等人用固化有428個探針的晶片對導致肺部囊性纖維化的突變基因進行了檢測[28]。用生物晶片作雜交突變檢測的美國公司有貝克曼儀器公司、Abbot laboratory、Affymetrix、Nanogen、Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hyseq、Molecular dynamics等;英美學術機構有賓夕法尼亞大學、貝勒醫學院、牛津大學、Whitehead institute for Biomedical Research，海軍研究室，Argonne國家實驗室等。

　　通過雜交分析DNA的另一應用技術是重複測序。那麼，重複測序是怎麼工作的呢?首先，人們將長度為8-20個核苷的探針合成並固定到指甲蓋大小的矽晶片或玻璃晶片上。當含有與探針序列互補的DNA被置於聯有探針的晶片之後，固化探針就會通過與其序列互補的DNA片段雜交而結合[10]。通過使用帶有計算機的熒光檢測系統對“棋盤”每個格子上的熒光強弱及根據每個格子上已知探針的序列進行分析與組合就可得知樣品DNA所含有的鹼基序列。最近美國的Science雜誌對應用晶片雜交技術測序作了報道。Chee等人在一塊固化有135000個寡核苷酸探針***每個探針長度為25個核苷***的矽晶片上對長度為16.6kbp的整個人線粒體DNA作了序列重複測定。每個探針之間的空間間隔為35微米。測序精度為99%。另外Hacia還報道了一種微測序分析法***minisequencing-based assays***為檢測所有可能的鹼基序列變化提供了強有力的手段。此方法中需要將不同顏色熒光染料標記的四種ddNTP，加入到引物的酶促反應中，微陣列上固化的寡核苷酸用作酶促反應的引物，靶序列作為模板，可檢測到靶序列上的鹼基變化。用生物晶片從事雜交測序的美國公司有Affymetrix和Hyseq[29]。

　　2.3.3 用作基因表達分析的DNA晶片

　　隨著人類基因組計劃的順序進行，越來越多的能夠表達的人基因序列以及引發疾病和能預測疾病的各種突變正在為人們逐漸認識。為了能夠同時對多個可能的遺傳突變進行搜尋、加快功能基因組學研究的程序，人們現已把越來越多的注意力放到了能同時提供有關多個基因及其序列資訊的所謂並行分子遺傳學分析***parallel molecular genetic analysis***方法上。功能基因組學所研究的是在特定組織中、發育的不同階段或者是疾病的不同時期基因的表達情況。因此它的要求是要能在同一時刻獲得多個分子遺傳學分析的結果。譬如，許多疾病引發基因可能會有數以百計的與表徵有關的特定突變，因而，要求能有同時篩檢這些突變的有效方法。另外，任何一個細胞中都會有上千個基因在表達。而細胞間基因表達的差異往往能反應出這些細胞是發育正常還是在朝惡性腫瘤細胞方向發展。採用晶片技術利用雜交對基因表達進行分析的好處是它能用很少的細胞物質便能提供有關多基因差異表達的資訊，從而給疾病診斷和藥物篩選提供前所未有的資訊量[30]。Lockhart等人採用固化有65000個不同序列的長度為20個核苷的探針晶片，定量地分析了一個小鼠T細胞線中整個RNA群體內21個各不相同的信使RNA。這些專門設計的探針能與114個已知的小鼠基因雜交。分析發現 在誘發生成細胞分裂後，另外有20個信使RNA的表達也發生了改變。檢測結果表明該系統對RNA的檢出率為1:300000，對信使RNA的定量基準為1:300[32]。Wang等人在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷***etoposide***誘導的細胞程式性死亡時，利用DNA晶片技術，製備了一次可檢測6591種人細胞信使RNA的寡聚核苷酸微陣列，檢測到誘導後的細胞內有62種信使RNA的量發生了變化。通過挑選12個與誘導作用有關的基因作進一步研究，它們發現了2個新的p53靶基因[33]。DeRisi等人將一個惡性腫瘤細胞線中得到的870個不同的cDNA探針通過機械手“刷印”至載玻片上以觀察癌基因的表達情況。在比較兩個標有不同熒游標記的細胞信使RNA群的雜交結果之後，他們對引入正常人染色體後腫瘤基因受到抑制的細胞中的基因表達結果進行了分析[34]。另外，Shoemaker等人報道了一種利用生物晶片來確定許多新近發現的酶母基因的生物功能的所謂分子條形編碼技術。這種技術的好處是它能讓我們以並行的方式定量地分析很複雜的核酸混合物[35]。Lueking等人最近採用蛋白質微陣列技術，把作為探針的蛋白質高密度地固定在聚雙氟乙烯膜***polyvinylidene difluoride***上，並檢測到了10pg的微量蛋白質測試樣。對92個人cDNA克隆片段表達的產物進行檢測，用單克隆技術作平行分析，證實了假陽性的的檢出率低。由於蛋白質微陣列技術不受限於抗原-抗體系統，故能為高效篩選基因表達產物及研究受體-配體的相互作用提供一條新的有效途徑[36]。

　　2.4 縮微晶片實驗室

　　生物晶片 發展 的最終目標是將從樣品製備、化學反應到檢測的整個 分析 過程整合化以獲得所謂的微型全分析系統或稱縮微晶片實驗室。1998年6月，Nanogen公司的程京博士和他的同事們首次報道了用晶片實驗室所實現的從樣品製備到反應結果顯示的全部分析過程。他們用這個裝置從混有大腸桿菌的血液中成功地分離出了細菌，在高壓脈衝破胞之後用蛋白酶K孵化脫蛋白，製得純化的DNA，最後用另一塊 電子 增強的DNA雜交晶片分析證實提取物是大腸桿菌的DNA。這是向縮微實驗室邁進的一個成功的突破[37]。 目前 ，含有加熱器、微泵微閥、微流量控制器、電子化學和電子發光探測器的晶片已經研製出來了，而且，也出現了將樣品製備、化學反應和分析檢測部分結合的晶片***例如，樣品製備和PCR[38];競爭免疫測定和毛細管電泳分離[39]***。相信不久的將來，包含所有步驟的縮微晶片實驗室將不斷湧現。

　　3 結尾

　　經過近十年的不懈努力，生物晶片技術發展至今已經開始對生命 科學 研究 的許多領域帶來衝擊甚至革命。以美國為首的西方發達國家在該領域已經取得了令人眩目的成就。到現在，從樣品製備、化學反應到檢測的三個步驟已獲得了部分整合，三個部分的全部整合已初現端倪。 中國 在這方面尚未起步，如果各方面重視，投入一定的人力和物力，相信不久的將來在該領域中我們也會佔有一席之地的。

　　參考 文獻

　　1 Koster H,et al.Nature Biotechnology,1996;14:1123-1128.

　　2 Wilkerson CW,et al.Applied Physics Letter,1993;62:2030-232.

　　3 Hang XC,et al.Analytical Chemistry,1992;64:2149-2154.

　　4 Southern EM,et al.Trends in Genetics 1996;12:110-118.

　　5 Pennisi E,Science 1996;272:1737.

　　6 Kricka LJ,et al.Journal of International Federation of&nbs p;Clinical Chemistry1994;6:54-59.

　　7 Kricka LJ,et al. Microfabricated Immunoassay Devices. In Principles & practice of Immunoassay ***2ndEdition***.Edited by Price CP and Newman DJ, Macmillan press,London,1996.

　　8 Cheng J,et al.NuclEic Acids Research 1996;24:380-385.

　　9 Manz A,Chimia 1996;50:140-143.

　　10 Cheng J,Molecular Diagnosis 1996;1:183-200.

　　11 Cheng J,et al.Sample preparation in microstructured devices, in Manz a,Bechar H.***eds***“Microsystem technology in Chemistry and life Scence”,a special volume in 12 Topics in current Chemistry Springer,HEIdelberg,1998;215-231.

　　13 Markx G H,et al.Microbiology,1994;140:585-591.

　　14 Northrup MA,et al.Proceedings of Transducers’95, the Eighth International conference on Solid-State Sensors and Actuators 1995;764-765.

　　15 Cheng J,et al.Analytical Biochemistry 1998;257/2:101-106.

　　nothrup MA,et al.Proceeding of the 8thInternational Conference on Solid-State Sensors and actuators, and Eurosensors IX, 1995; 764-767.

　　16 Taylor TB, et al.Nucleic Acids Research 1997;25:3164-3168.

　　17 Mrtin UK, et al.Science 1998;280:1046-1048.

　　18 Pace SJ,US Patent 4,908,112,1990.

　　19 Manz A,et al.J.Choromatogr,,1992;593:253-258.

　　20 Wooley aT,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994;91:11348-11352.

　　21 Woolley AT,et al.Anal.Chem,1997;68:4285-2186.

　　22 Woolley AT,et al.Anal.Chem,1996;68:4081-4086.

　　23 Fodor SPA ,et al.Science,1991;251:767-773.

　　24 Sosnowski RG,et al.Proc.Natl.Acad.USA,1997;94:1119-1123.

　　25 Kreiner t.,Rapid genetic sequence analysis using a DNA probe array system.Ame.Lab.,1996.

　　26 Hacia JG,et al.Nature Genet,1996;14:441-447.

　　27 Kozal MJ,et al.Nature Medicine,1996;2:753-759.

　　28 Cronin MT,et al.Human Mutation,1996;7:244-255.

　　29 Cheng J,et al.Molecular Diagnosis,1996;1:183-200.

　　30 Hacia J G,Nature genetics supplement,1999;21:42-47.

　　31 Scangos G,Nature Biotechnol,1997;15:1220-1221.

　　32 Lockhart DJ,Nature Biotechnol,1996;14:1675-1680.

　　33 Wang Y,et al.FEBS Letter,1999;445:269-273.

　　34 DeRisi J,et al.Nature Genet,1996;14:457-460.

　　35 Shoemaker DD, et al.Nature Genet, 1996;14:450-456.

　　36 Lueking A, et al.Anal Biochem,1999;270:103-111.

　　37 Cheng J,et al.Nature Biotechnology,1998;16:541-546.

　　38 Wilding P,et al.Anal.Biochem,1998;257:95-100.

　　3 9 McCormick RM,et al.Anal.Chem.1997;69:2626-2630

　　篇二

　　肝癌的生物治療

　　【摘要】 生物 治療 作為腫瘤治療的新概念備受關注，已成為繼手術、放療、化療後腫瘤治療的第4種模式。隨著 現代 分子生物學技術和基因工程技術的迅速 發展 ，為原發性開闢了全新的領域，並已取得了越來越多可喜的成果，分子靶向治療、免疫治療、基因治療、內分泌治療、幹細胞治療等顯示出了良好的應用前景。就生物治療在肝癌治療中的研究和應用作一概述。

　　【關鍵詞】 肝腫瘤·生物治療

　　原發性肝癌***primary hepatocellular carcinoma，PLC***中90%為肝細胞性肝癌***hepatocellular carcinoma，HCC***。隨著現代分子生物學技術和基因工程技術的迅速發展，為PLC的生物治療開闢了全新的領域，生物治療已成為繼手術、放療、化療後腫瘤治療的第4種模式，並顯示出了良好的應用前景。主要包括：分子靶向治療、免疫治療、基因治療、內分泌治療、幹細胞治療等。

　　1　分子靶向治療

　　HCC的發病機制十分複雜，其發生、發展和轉移與多種基因的突變、細胞訊號傳導通路和新生血管增生異常等密切相關，其中多個關鍵性環節，是進行分子靶向治療的理論基礎和重要的潛在靶點。分子靶向藥物治療PLC已成為新的研究熱點。靶向治療是將免疫分子、分子受體或脂質體等載體，與藥物、放射性核素或生物毒素等偶聯，靶向性殺傷腫瘤細胞。

　　1.1　針對表皮生長因子及其受體的靶向治療

　　表皮生長因子***epidernal growth factor，EGF***是生長因子家族的主要成員之一，是含53個氨基酸殘基的多肽激素。EGF可以強烈刺激細胞分裂，與胚胎的發生與生長、組織的修復與再生以及腫瘤的發生有密切的關係。EGF及其受體***EGFR***在PLC中存在過表達[1]，與PLC的形成、發生、發展有密切關係[2-4]。抗EGFR藥物如埃羅替尼***erlotinib***和西妥昔單抗***cetuximab***，能夠靶向性作用於腫瘤細胞表面的EGFR，有效阻斷由EGFR介導的下游訊號傳導通路和細胞學效應，並誘導EGFR內化和降解。但近年多項臨床研究顯示，抗EGFR治療對PLC患者的療效並不顯著[5]，因而抗EGFR治療在HCC的治療上尚存在一定爭議。

　　1.2　抗血管生成治療

　　腫瘤生長、代謝、浸潤轉移和復發均與腫瘤的血液供應密切相關。PLC是一種富血管的惡性腫瘤，惡性程度高、生長速度快、轉移範圍廣、複發率高。目前已證實腫瘤患者體記憶體在多種血管生成因子，其中血管內皮生長因子***vascular endothelial growth factor，VEGF***是體內作用最強的一種血管生成因子[6]。PLC患者VEGF血清水平顯著的高於肝臟良性病變患者和正常人群[7]。缺氧是VEGF最強烈的誘導劑[8]，由於腫瘤細胞在不斷生長過程中對氧的需要不斷增加，而腫瘤周圍組織供氧量有限，因此導致腫瘤分泌大量VEGF，不斷促使新生血管生成，以滿足腫瘤生長的需求。此外，VEGF誘導新生的腫瘤相關血管結構不完善且通透性強，部分腫瘤細胞可以穿過血管壁進入血管向遠處轉移，故加速了腫瘤浸潤和轉移[9]。在PLC患者中，己發生轉移的患者VEGF血清水平也較未發生轉移的患者顯著增高[9]。因此，VEGF在PLC的生長、浸潤、轉移、治療和提示預後方面都有重要的作用。近年來，抗血管生成治療在 HCC的治療中佔據了越來越重要的地位。目前臨床上應用最廣泛的抗血管生成藥物包括VEGF抑制劑貝伐單抗***bevacizumab，Avastin***和Brivanib等。貝伐單抗是一種新型的抗VEGF的人源化單克隆抗體，可結合VEGF並防止其與內皮細胞表面的受體***Flt-1和 KDR***結合而發揮作用、減少腫瘤內的血管形成，從而使腫瘤組織無法獲得生長、增殖所需的血液、氧及其他養分，最終導致腫瘤壞死。近年來，有學者將貝伐單抗用於不能手術和介入治療的晚期HCC患者，取得了較好的效果[10]。

　　1.3　訊號傳導通路抑制劑治療

　　哺乳動物雷帕黴素靶蛋白***mammalian targetof rapamycin，mTOR***是哺乳動物磷脂醯肌醇/蛋白激酶***PI3k/Akt***通路的下游效應物，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR通過調節其他激酶，如40S核糖體6激酶***S6k***，細胞週期依賴蛋白激酶***cyclin-dependent kinases，CDK*** 和真核細胞翻譯起始因子***4E結合蛋白，4EB*** 的磷酸化，在蛋白質翻譯過程中起重要調節作用。雖然與 mTOR有關的訊號傳導途徑尚未完全闡明，一個很明顯的事實是mTOR參與了蛋白質合成的調節，並與生長因子及其受體、細胞週期程序及膜運輸相互作用[11]。生長因子啟用 PI3k和Akt，然後通過mTOR介導大量蛋白激酶S6k、CDK、4EBP磷酸化，影響腫瘤細胞的存活和增殖[12]。VEGF通過介導激酶鏈 PI3k-Akt-mTOR調控血管內皮細胞的增生、存活和轉移[13]。抑制 mTOR的功能可以消除由 PI3K/Akt通路介導的增殖訊號，使細胞週期阻滯，抑制腫瘤生長，因此mTOR抑制劑作為一種抗腫瘤藥物的作用最近再次引起關注。目前已有西羅莫司***Sirolimus***和依維莫司***Everolimus***2種商品化抗mTOR的藥物。

　　1.4　多靶點抑制劑治療

　　研究表明，Raf/MAPK-ERK激酶***MEK***和細胞外訊號調節激酶***ERK***通路在HCC發病過程中有一定作用[14]。此外，HCC細胞系內過度表達的活化MEK1可通過阻止細胞凋亡而促進腫瘤的生長和存活。HCC是一種富血管性腫瘤，VEGF 可促進 HCC的發展和轉移。因此，阻斷通過Raf/MAPK-ERK的訊號傳導及VEGF的作用可能會對HCC起到治療效果[15]。

　　分子靶向治療在控制HCC的腫瘤增殖、預防和延緩復發轉移以及提高患者的生活質量等方面可能具有獨特優勢;循證醫學高級別證據已充分證明基因治療藥物可以延長晚期HCC患者的生存期，而聯合其他治療藥物或方法有可能取得更好的效果。

　　2　免疫治療

　　目前免疫治療對臨床已生長的實體瘤的消除能力尚十分有限，對大量的腫瘤細胞也難以奏效，在臨床上多用於手術、介入等方法的輔助治療，或不能耐受化療以及不能手術切除的HCC患者。包括主動免疫、非特異性免疫、過繼免疫和聯合免疫等。

　　2.1　主動免疫治療

　　主動免疫治療是指利用腫瘤細胞的特異性物質誘導患者產生特異性免疫，進而主動殺傷腫瘤細胞的過程，目前用於臨床的PLC主動免疫包括HCC腫瘤疫苗、樹突狀細胞疫苗。

　　2.1.1 HCC腫瘤疫苗

　　是將自身或異體同種HCC細胞經過物理因素***如照射、高溫***、化學因素***如酶解***及生物因素***如病毒感染、 基因轉移***等的處理，改變或消除其致瘤性，保留其免疫原性，輸入體內，刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫，達到治療PLC、預防HCC轉移和復發的目的[16]。人類腫瘤免疫排斥抗原——黑色素瘤抗原家族***melanoma antigens，MAGEs***的發現，為腫瘤的免疫治療提供了特異性抗原。由於MAGE抗原能被腫瘤組織特異性表達且可與人類白細胞抗原***human leucocyte antigen，HLA***1和HLA2形成抗原肽/HLA複合物，能被殺傷T細胞***cytotoxio T lymphocyte，CTL***識別和殺傷，提示MAGE抗原用於PLC的免疫治療，開發腫瘤疫苗有著廣闊的前景。

　　2.1.2　樹突狀細胞疫苗

　　樹突狀細胞***dendritic cell，DC***是體內功能最強的專職抗原遞呈細胞 ***antigen presentinz cell，APC***，可以刺激初始T細胞增殖、誘導初始免疫應答，在抗腫瘤細胞免疫應答中發揮重要作用。腫瘤可使DC功能失常，使之處於非成熟狀態。只有成熟的DC才能有效呈遞抗原，以誘導機體產生有效的抗癌免疫應答[17]。目前用DC疫苗治療HCC臨床應用報道不多，有待進一步研究和探討。

　　2.2　非特異性免疫治療

　　非特異性免疫治療的目的：腫瘤相關抗原在惡性腫瘤細胞上的表達比正常細胞高得多，並足以使這些抗原成為有效的攻擊目標。另外，可通過激發免疫系統的免疫效應、修飾免疫應答等方法，非特異性地增強機體對腫瘤的免疫排斥能力。

　　常用非特異性免疫製劑包括：1***生物製劑，主要是重組的細胞因子，如IL、IFN、TNF等，既可單獨使用，也可聯合應用;2***微生物及其產物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、混合菌苗、溶鏈菌和高聚金葡素等;3*** 胸腺肽;4***中醫藥。

　　2.3　過繼免疫治療

　　過繼免疫治療以輸注自身或同種特異性或非特異性腫瘤殺傷細胞為主，不僅可糾正細胞免疫功能低下，而且可直接發揮抗腫瘤作用。包括：淋巴因子啟用的殺傷細胞、腫瘤浸潤的淋巴細胞、細胞毒性T細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞等。

　　2.3.1　淋巴因子啟用的殺傷細胞

　　淋巴因子啟用的殺傷細胞 ***lymphokine activated killer cell，LAK cell***是用高濃度 IL-2啟用的腫瘤患者自體或正常供者的外周血單個核細胞，LAK細胞在體外有廣譜的抗自體及異基因腫瘤的活性，可直接溶解、殺傷瘤細胞[18]。LAK細胞半衰期短，與 IL-2聯合應用，可保持LAK細胞的活性，以保證療效。IL-2/LAK細胞治療對PLC根治性切除術後預防復發有較高的價值。

　　2.3.2　腫瘤浸潤的淋巴細胞

　　腫瘤浸潤的淋巴細胞 ***tumor infiltrating lymphocyte，TIL***為腫瘤組織分離出的淋巴細胞經IL-2培養而產生，為自體腫瘤特異性殺傷細胞。目前認為，TIL 對腫瘤細胞的殺傷活性較LAK細胞高。

　　2.3.3　細胞毒T淋巴細胞

　　細胞毒T淋巴細胞***cytotoxic T lymphocyte，CTL***為特異性抗原體外誘導單核細胞克隆。CTL需第1訊號系統***MHC，TCR***和第2訊號系統***共刺激分子如 B7***啟用，具有腫瘤殺傷特異性。 Haruta 等[19]報道，對晚期PLC患者而言，CTL的治療效果要優於LAK細胞。

　　2.3.4　細胞因子誘導的殺傷細胞

　　細胞因子誘導的殺傷細胞 ***eytokine-induced killer cell，CIK cell***為 MabCD3***抗 CD3單抗***、IL-1、IFN-γ和 IL-2培養的正常人外周血淋巴細胞。來源於CD3+CD56- T淋巴細胞具有廣譜的抗腫瘤活性，在動物實驗中有較好的治療效果[20]。

　　2.4　聯合免疫治療

　　由於腫瘤生物學特性所具有的特殊免疫逃逸機制，導致單一性免疫治療難以奏效，因此聯合治療成為目前臨床免疫治療的首選。在化療過程中提高患者免疫力，對抗化療藥物免疫抑制的副作用，起到協同作用。

　　3　基因治療

　　研究表明，PLC發生有單中心及多中心，且與個體的基因缺陷有關。多基因、多階段的癌基因或抑癌基因變構為PLC發生、發展的分子基礎[21]。PLC的基因治療是在基因調節水平上進行操作以殺傷或抑制腫瘤細胞的治療方法。隨著DNA 重組技術和轉基因方法的不斷完善，基因治療的研究獲得了迅猛發展。

　　3.1　抑癌基因 治療

　　抑癌基因治療是將具有正常功能的野生型抑癌基因***如 p53、p66等***通過各種途徑轉染至腫瘤細胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢復細胞的正常生長表型，或者誘導細胞凋亡，從而達到控制腫瘤細胞生長的目的。p53基因是目前研究和應用得最多的一個，不僅可抑制癌細胞生長，還可誘導其凋亡;p16基因能阻抑細胞生長，但不誘發凋亡。p53反義核酸或向細胞內匯入 wt-p53的基因治療，可以抑制腫瘤的增殖，誘導凋亡，提高對藥物的敏感性[22]。Okimoto等[23]將帶有野生型p53基因的腺病毒載體Adomv p53通過肝動脈注入小鼠RCN-9結腸癌細胞肝轉移模型，48 h後，經腹腔注射順鉑***CDDP***，發現轉移的PLC細胞廣泛凋亡而肝臟功能並未受損。

　　3.2　自殺基因治療

　　自殺基因療法又被稱為“病毒介導的酶/前體藥物治療***virus-directed enzyme/prodrug therapy，VDEPT***。原理是把某些病毒、細菌中特有的轉換酶基因——自殺基因匯入體內後，利用其產生的酶將無毒或低毒的藥物前體轉成細胞毒性代謝產物，從而殺死腫瘤細胞的基因治療方法。目前，用於PLC基因治療的自殺基因系統有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶***HSV2TK***基因/無環鳥苷***GVC***系統、胞嘧啶脫氨酶***CD***基因/5-氟胞嘧啶***5-FC***系統和嘌呤核苷酸磷酸酶***PNP***基因/氟達拉濱系統等。Harada等[24]以EB病毒基因組成的質粒載體與非病毒載體PAAD結合成雜交載體介導HSV-TK/GCV系統，能有效治療實驗小鼠PLC。

　　3.3　免疫基因治療

　　免疫基因治療通過基因重組技術增強機體的抗腫瘤免疫功能而達到治療腫瘤的目的。免疫基因治療可分為2類: 一種是將細胞因子基因匯入PLC細胞，通過增強腫瘤細胞表面腫瘤抗原性、MHC 分子或黏附分子的表達而提高免疫原性;另一種是將細胞因子基因匯入免疫活性細胞，如LAK細胞和樹突狀細胞等，通過直接刺激免疫效應細胞而達到增強免疫反應、抑制腫瘤生長的目的。目前，常用的細胞因子有IL-2、IL-12、IL-18、TNFα、IFN和集落刺激因子等。IL-12是作用較顯著的細胞因子之一。Harada等[25]研究發現以IL-12基因治療免疫抑制狀態下的鼠PLC模型，可明顯增加腫瘤細胞周圍淋巴細胞的浸潤並增強腫瘤特異性殺傷細胞的反應;IL-12可顯著抑制腫瘤的復發。其他免疫基因治療還包括IL-12和IL-2聯合轉染、IL-12和TNF、GM2CSF和IL-2 聯合應用等。

　　3.4　反義基因治療

　　PLC的發生、 發展 過程中許多癌基因及生長因子的基因產物大量表達，運用反義技術可以抑制這些產物的過度表達，從而抑制腫瘤的生長。根據PLC發病原因，匯入反義寡核苷酸封閉PLC基因的表達或用正常抑癌基因取代突變抑癌基因。已報道設計針對VEGF、端粒末端轉移酶、c-myc等癌基因的表達途徑，誘導PLC細胞凋亡抑制其生長[26]。反義技術的主要缺點是目的基因的靶向性欠佳和半衰期較短，目前一般作為手術和化療的輔助治療方法。

　　3.5　聯合基因療法

　　PLC的發生涉及到多基因參與，因此單用一種基因治療效果有限。不同的基因治療策略聯合應用可相互協同，增強抗腫瘤效果常採用免疫基因和自殺基因的聯合治療。Drozdz等[27]聯合HSV-TK和IL-12治療效果都明顯優於單個基因治療。

　　儘管目前有多種細胞因子、抑癌基因等可用於腫瘤的基因治療，但總體來講，效果尚不理想，因而尋找更多更具殺傷力的基因將大大推動基因治療的研究和應用範圍。基因治療尚存在諸多理論上和技術上的問題，如靶向性、基因載體的轉移效率、匯入基因的持續表達、基因治療的安全性等問題，還有待進一步完善[28]。

　　4　內分泌治療

　　在PLC患者中有33%的病例可查出雌激素受體，使用抗雌激素的三苯氧胺治療PLC已有報道。有學者認為，大劑量口服三苯氧胺可作為逆轉多藥耐藥基因的藥物。然而，最近幾次大樣本的RCT和Meta分析卻未發現有統計學意義[29]。

　　5　幹細胞治療

　　幹細胞移植現已成為惡性血液病、實體瘤等疾病的根治性方法之一。近年來，已有多個學者研究報道了造血幹細胞參與了肝組織的再生和修復過程。它是利用血液成分分離裝置處理血液，採取存在於末梢血中的造血幹細胞進行移植的手段。由於PLC化療敏感性較低，以現有水平，行造血幹細胞、骨髓移植有一定困難。

　　6　結語

　　總之，經過多年的研究，生物治療技術已取得了越來越多可喜的成果，並顯示出了廣闊的應用前景。生物治療技術在PLC的綜合治療中將發揮越來越重要的作用。我們有理由相信不久的將來，HCC的生物治療會逐漸過渡成為一種常規的治療方法,為PLC患者帶來福音。

　　【 參考 文獻 】

　　[1] Daveau M, Scotfe M, Francois A, et al. Hepatocyte growth factor，transforming growth factor alpha，and thEir receptors as combined markers of prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2003,36***3***:130-141.

　　[2] Moser GJ, Wolf DC，Goldsworthy TL. Quantitative relationship between transform ing growth factor-alpha and hepatic focalphenotype and progression in female mouse liver[J]. Toxicol Pathol, 1997,25***3***:275-283.

　　[3] Kira S, Nakanishi T, Sumori S, et al. Expression of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor in human hepatocellular carcinoma[J]. Liver, 1997,17***4***:177-182.

　　[4] Decicco L A, Kong J, Ringer DP. Carcinogen-induced alteration in liver epidermal growth factor receptor distribution during the promotion stage of hepatocarcingenesis in rat[J]. Cancer Lett, 1997,111***1-2***：149-156.

　　[5] Vlahovic G, Crawford J. Activation of tyrosine kinases in cancer[J]. Oncologist, 2003,8***6***:531-538.

　　[6] Kraizer Y, Mawasi N, Seagal J, et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001,287***1***:209-2l5.

　　[7] Zhao J, Hu J, Cai J, et al. Vascular endothelial growth factor expression in seFam of patients with hepatocellular carcinoma[J]. Chin Med J***Eng1***, 2003,116***5***：772-776.

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