光學顯微攝影的用光方法與技巧

　　光學顯微攝影即顯微攝影電子顯微攝影而用的術語。由物鏡***倍率2-100倍***和目鏡***5-15倍***的組合，若用35毫米照相機，可在膠片上拍成5-800倍。若為六寸片，能拍出20-3000倍的照片，但光學顯微鏡倍率限度約為1200倍。若超出此限度進行擴印，無法獲得清晰的像。光學顯微攝影必須要有明亮、均勻、無反光的照明，同時要注意光源的調節和色溫的變化。 另外，由於樣品的效能差異，還要選用不同的照明方法。下面是小編為您整理的關於，希望對您有所幫助!

　　一、光學顯微攝影的用光

　　光學顯微攝影的照明，會對物鏡解像力產生明顯影響，一般要求光源的輸出能夠集中到很小面積上，光強高、熱量小，幾何尺寸不大。

　　在一般明視場照明顯微攝影時，通常採用6伏或者12伏螺口形白熾鎢絲燈泡做照明光源，色溫為2700～3200K，其亮度的調整由變壓器實現，這種照明儘管看上去很亮，色溫並不高，所以，應儘量用最高電壓，使燈光亮度、色溫提高，並使用RAW格式拍攝，以便後期校正色溫。

　　但是，白熾鎢絲燈泡長期使用，其鎢絲蒸發後所產生的沉物會積聚在玻璃罩內壁，這樣會降低亮度與色溫。所以，12伏100瓦的鹵素鎢絲燈光便成了光學顯微攝影的優質光源。***這種鹵素鎢絲燈在燈管內充鹵素氣體，在燈絲點燃後，蒸發出來的鎢會與鹵素氣體形成鹵化鎢，附著在燈管內壁，而關閉電源冷卻時，鹵化鎢又會分解，屆時鎢又回到燈絲上去，這樣便延長了燈泡的使用壽命 ，改善了光源照明，縮小了燈泡的幾何尺寸，提高了光源強度***。

　　用於光學顯微攝影的光源還有氙燈、鋯燈、電子閃光燈、汞蒸氣燈等，可以根據不同的目的，選用適當的光源。如氙燈不僅可以發出連續的可見光，還包含長波紫外線和紅外光譜部分;汞蒸氣是優質的單色光源，特別適於單色黑白顯微攝影。

　　拍攝顯微照片，要求有明亮、均勻、無反光的照明條件，其照明方法可分為兩類，即透射照明和反射照明***落射光照明***

　　透射光照明是指從光源射出的光線從標本的下面透過標本進入物鏡。而落射照明是指光線從正面投射到標本的正面，物鏡接受的光是從標本反射來的光。

　　落射光照明主要用於拍攝不透明的標本，如面板、小生物、植物果實表面等。拍出的像有立體感。落射光與物鏡之間的角度越小越好，現代顯微攝影裝置的落射光大多與物鏡合軸。 在沒有專業裝置的情況下可以用斜射照明，在對應面加反光屏，或用另一隻燈做輔助光，也可以使用環形閃光燈。

　　二、光學顯微攝影的曝光控制

　　雖然現在的相機均有自動測光或自動曝光功能，但是如果一個視野中亮處面積超過二分之一，則易出現曝光不足的現象，所以如果標本主體小，又處在亮背景中，就要適當增加曝光時間。

　　在控制曝光時，要注意以下因素：

　　1. 光源強度的影響： 由於電壓的變化，光源亮度可能產生5-10倍的變化。

　　2. 光源的距離及對標本的照射面積。

　　3. 光源的波長及色溫。 光源的波長長、色溫低，色光偏紅時，曝光時間要長些。光波短，色溫高，色光偏青時，曝光時間要短些。

　　4. 電壓的波動會引起曝光量的改變，所以攝製過程中要保持電壓的相對穩定。

　　5. 聚光器的位置經過實驗固定後不宜改動。

　　6. 使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數增加曝光時間***手動曝光***。

　　7. 目鏡的放大倍率。 以×5倍的目鏡作曝光基準1時，×10倍目鏡要4倍的曝光量，×15倍目鏡要增至9倍的曝光。

　　8. 物鏡的倍率和N·A值： 如果把×10倍的目鏡作為1時，×40倍目鏡要2.5倍的曝光，×100倍的物鏡要4倍的曝光。

　　9. 從目鏡出射點到感光片的距離

　　10. 標本的染色也會對曝光產生影響

　　11. 標本與目鏡間的介質折射率大、曝光時間短，反之，曝光時間長。曝光時間與折射率成反比。

　　12.聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產生2～20倍的變化。

　　三、光學顯微攝影中濾色鏡的應用

　　濾色片幾乎在拍攝什麼樣的標本都有用場。例如：

　　1. 用濾色片校正反差突出重點光學顯微攝影往往要突出重點，這就要使用適當的濾色鏡加強反差，強調需要突出的重點結構 ，而減弱其非重點部分。使用標本染色補色的濾色鏡可以增強標本反差，比如蘇木精染出的色標本中用綠濾色鏡，就可增強反差。

　　2. 兩種顏色的結構體現： 如果想使標本中兩種以上的顏色都清楚地呈現在畫面上，如紅、藍兩種顏色，可以採取兩次曝光的方法，先用紅濾色鏡，再用藍濾色鏡各曝一次光，就可以清楚地體現兩種顏色的結構 。

　　3. 短波光濾色鏡可以提高對標本的解析度。 短波光濾色鏡***如UV鏡***可以分辨出在可見光下肉眼看不見的組織結構。用紫外線濾色片配合紫外膠片可提高成像可分辨，達到560～1000線/毫米。 紫外線光源的射線很熱，採用一般濾色片容易烤焦標本，所以要用液體濾光器，其內裝有氯化銅或硫酸銅溶液30克/升。這不僅可以防熱、吸收紅外線尚可讓紫外線通過。