電鏡技術論文

　　電鏡技術已廣泛用於病毒的形態特徵、分子結構以及與宿主細胞相互作用的研究，小編為大家整理的，希望你們喜歡。

　　篇一

　　電鏡樣品製備技術的應用

　　【關鍵詞】電鏡樣品;製備;諮詢

　　隨著科技和經濟的高速發展，科研、醫療及診斷水平快速提高，電子顯微鏡在現代生物醫學研究中的應用越來越廣泛，研究內容越來越豐富，針對性越來越強，加之生物樣品多樣化，對電鏡樣品製備技術提出了更多更高的要求。為了避免實驗的盲目性，避免因解釋不夠、實驗準備不充分、操作不當引起的糾紛，減少實驗的失敗率，務必要抓好電鏡樣品製備技術。

　　1電鏡樣品製備的基本要求

　　首先根據實驗的需要，擬定實驗計劃，制定出實驗流程，根據經濟承受能力合理選擇實驗分組和時相點。其次，正確取材腹腔鏡下賁門食管區區域性解剖的臨床意義很關鍵：取材固定要快，必須在固定液中及時修小。固定液由電鏡室提供，不能自己配製***特殊標本除外***。標本儲存在4 ℃冰箱，不得冰凍。樣品處理步驟多而複雜，耗時長，所以要預計鏡下觀察結果的時間，便於安排實驗。

　　2特殊電鏡樣品的製備方法

　　針對不同的實驗目的，不同的標本取材，尋求不同的電鏡樣品製備方法。作者經過長期的實驗反覆摸索，得到許多有應用價值的新技術、新方法，為有類似課題研究的科研人員的電鏡技術諮詢提供理論依據。例如要觀察組織細胞中的鈣，只有採用鈣離子捕捉法，通過細胞化學間接地來進行鈣的定位[1]。為了促進組織細胞內鈣化學充分反應，就如何選擇底物、捕捉劑、如何配製試劑和灌注固定等進行摸索，得到有效的、可行的電鏡樣品製備方法，可供參考。如果要觀察培養細胞間連線，建議採用改進的薄膜細胞培養法，優勢在於細胞超微結構儲存良好，能保持細胞間原有的位置關係，利於反覆切片，解決了單層培養細胞頂扣包埋後切片難、成功率低的問題[2]。懸浮細胞培養，懸浮物質作為懸浮細胞生長載體是近年組織工程研究的新方法，如何觀察懸浮細胞生長狀態的真實超微結構影象是電鏡制樣的新課題。改進的懸浮細胞直接沉降法和懸浮物質直接移液法，解決了傳統的懸浮細胞掃描電鏡制樣細胞和物質容易丟失、細胞表面特殊微細結構儲存不好的問題[3]。電鏡免疫技術應用越來越廣泛，但制樣複雜，影響因素多，陽性率低。在樣品製備技術諮詢時，根據實驗要求和不同的組織細胞，不斷查閱文獻，共同探討，合理選擇標記物、固定液、免疫染色和電子染色等，使免疫電鏡技術不斷提高，逐步成熟，為科研快速發展奠定基礎。

　　3利用電鏡技術使用者資源提供技術諮詢

　　電鏡室是為科研人員服務的，是裝置和專業技術力量較集中的單位。為了提高創新能力，擴大交流合作，加強校內外資訊溝通，與科研人員共同建立了電鏡技術使用者資源共享平臺，提供相關的技術諮詢服務。建立電鏡技術使用者資源庫，詳細記錄了使用者名稱、實驗日期、實驗目的、標本型別、制樣步驟和方法、實驗結果、所在單位和***等，相關科研人員只需採取簡單而靈活的電話諮詢或發郵件等方式進行技術經驗交流，包括試劑的購買廠家或貴重試劑合用，試劑的配製，實驗流程，標本處理方法，實驗操作中的改進措施，實驗結果的分析等。實踐證明，實驗前通過使用者與電鏡專業技術人員、使用者與使用者之間的電鏡技術諮詢，相互借鑑，共同探討，促進了科研人員之間的交流與合作，擴大了宣傳。實驗成功的技術方法和理論成果被廣泛推廣應用，電鏡技術不斷被重新整理，積累了許多有應用價值的電鏡樣品製備經驗，豐富了形態學研究的內容。

　　科研的成功在於把關每個環節，對於形態學研究要認真對待電鏡樣品製備技術的諮詢，明確方向，擬訂實驗方案，不斷創新並解決技術難題，才能使超微結構研究取得突破性進展，適應現代醫學的發展。

　　【參考文獻】

　　[1] 陶忠芬，李文剛，等.大鼠膀胱平滑肌過度充盈後鈣離子分佈的變化[J]. 第三軍醫大學學報， 2006，28***6***：608-609.

　　[2] 趙娟，徐淑梅.一種澱粉樣蛋白電鏡標本製備的新方法[J].天津醫藥，2007，35***4***：287-288.

　　[3] 路菊,陶忠芬,等.懸浮狀物質的樣品製備及掃描電鏡觀察[J].第三軍醫大學學報,2007，29***4***：368-369.

　　篇二

　　浮游病毒的電鏡觀察

　　摘要：直接用戊二醛固定水樣中的浮游病毒，通過超速離心使已固定的浮游病毒沉澱到覆有Formvar膜和碳支援膜的銅網上，經醋酸雙氧鈾染色後，利用透射電鏡對湖水中的浮游病毒進行觀察，結果可觀察到球形、桿狀和蝌蚪狀等形態各異的浮游病毒顆粒及球形病毒的囊膜子粒、桿狀病毒的核衣殼、具有不同尾部的蝌蚪狀病毒等的精細超微結構，從而建立了一種簡便、快捷和高效研究浮游病毒的電鏡方法。

　　關鍵詞：電鏡觀察;浮游病毒：超微結構

　　中圖分類號：Q939.48

　　文獻標識碼：A

　　文章編號：1007-7847***2007***01-0048-04

　　電鏡技術已廣泛用於病毒的形態特徵、分子結構以及與宿主細胞相互作用的研究，電鏡觀察可為病毒的形態、超微結構及分類定位提供最直觀的依據，但要通過電鏡對水樣中的病毒進行觀察，通常必須對水樣進行濃縮和病毒分離，

　　浮游病毒是存在於水體中的病毒，浮游病毒也是指水生態系統中的病毒，目前被普遍認為是水體微生物群落中豐富且重要的活性成分，它能調節水體中異養細菌，藍藻和真核藻類的物種多樣性和生物產量，影響生物地化迴圈，介導水生態系統中微生物之間的基因轉換，對水環境乃至整個生態系統都具有重要影響，因此受到人們的廣泛關注，近些年已有報道指出，浮游病毒存在不同的形態類群。

　　從水樣中分離濃縮病毒，不僅過程繁雜、耗時長、費用高，還會使水樣中病毒的數量及完整性受損，可否免去分離濃縮程式，直接對水樣中的浮游病毒進行制樣和電鏡觀察呢?因此，本文著重對水樣中浮游病毒樣品的不同製備方法及電鏡觀察效果進行比較。

　　1 材料與方法

　　1.1 水樣的採集

　　將取樣器浸入武漢東湖水面以下10cm處取出水樣，裝入收集瓶內，立即加入戊二醛***按體積比水樣：戊二醛=9:1，使之終濃度為2.5%***進行固定，並迅速將固定後的水樣置於4℃冰箱內儲存，備用。

　　1.2 制樣

　　方法之一：水樣直接滴到銅網上，採用常規的滴染法，即把水樣直接滴在覆有Formvar膜和碳支援膜的銅網上，使形成一小液珠，放置片刻，用濾紙條吸去多餘的液體，自然乾燥。

　　方法之：水樣經超速離心到銅網上，參照劉豔鳴等的方法***2005***，以25000r/min離心3h，使病毒沉澱到銅網上，棄去上清，空氣乾燥，

　　1.3 染色

　　醋酸雙氧鈾染色，在蠟盤中滴加2%的醋酸雙氧鈾，然後將上述乾燥好的銅網漂浮在染液上，染色2-3min。

　　磷鎢酸染色，將2%的磷鎢酸滴加到蠟盤中，將上述乾燥好的銅網插入其中，染色2-3min，

　　1.4 電鏡觀察

　　在JEM-1230型透射電鏡下觀察，加速電壓為100kV，利用GATAN INC CCD影象傳輸系統，獲得電鏡圖片。

　　2 結果

　　2.1 制樣方法對觀察效果的影響

　　我們分別採用了兩種制樣方法和兩種染色方法。結果顯示：不同的制樣和染色方法對電鏡觀察效果有明顯的影響。

　　利用方法一所製備的樣品，無論經醋酸雙氧鈾染色，還是磷鎢酸染色，都存在雜質多，背景暗，而病毒顆粒少的情況，甚至許多視野看不到病毒顆粒，可見，該方法不適宜製備浮游病毒的樣品。

　　利用方法二所製備的樣品，經磷鎢酸染色後，整個影象背景雜亂，病毒顆粒分佈不均勻，形態模糊，該方法也無法對水樣中的浮游病毒進行準確觀察。

　　同樣利用方法二所製備的樣品，經醋酸雙氧鈾染色後，可觀察到大量形態和數量不同的病毒顆粒，因此該方法可有效用於浮游病毒的形態觀察及計數分析，下述電鏡圖片均是通過該方法得到的。

　　2.2 浮游病毒的種類、形態及精細結構

　　用方法二所製備的浮游病毒樣品，在透射電鏡下，不僅可清晰地觀察到病毒顆粒的形態，如球形、桿狀和蝌蚪狀等***圖1***，還能瞭解其部分精細結構，包括球形病毒的子粒、桿狀病毒的核衣殼***橫紋狀結構***和蝌蚪狀病毒的尾髓等.

　　2.3 浮游病毒的計數分析

　　在進行樣品觀察時，可以根據需要來調節電鏡的放大倍數，如要了解病毒的精細結構時，可將放大倍數調節到8-10萬倍;如要對水樣中的浮游病毒進行計數分析，就將放大倍數調低至2萬倍左右，在此條件下，視野較寬，病毒的形態及數量都清晰觀察到

　　3 討論

　　我們採用了不同的制樣和染色方法，對水體中的浮游病毒進行觀察，結果顯示，常規的直接滴染法雖然簡便快捷，但由於浮游病毒在水體中的含量與分離或純化後的樣品相比，其量相對較少且分佈不均勻，影象背景雜亂、不清晰，故很難獲得滿意的電鏡圖片，其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、細胞碎片等固體雜質混在一起，吸附到銅網上，對病毒形態的觀察和圖片拍攝造成干擾。

　　採用超離法制樣，可得較好的結果，這是由於在離心力的作用下，一些比病毒顆粒要大的物質首先沉降到銅網上，並形成一個電子密度高且較均勻的背景，為浮游病毒的觀察起託襯作用，值得注意的是，此方法的離心速度較為關鍵，實驗表明，用25000r/min的轉速***Beckman L-90K超速離心機，SW41轉頭***比較適宜，這是由於用過大的離心速度，就會使有蝌蚪狀病毒的尾巴折斷或損傷;而離心速度過小，則難使體積較小的病毒沉降到銅網上，不能全面真實地反映待檢水體中浮游病毒的形態多樣性及含量等情況，另外，每次離心加入待測水量的多少，要根據水樣中浮游生物、其它懸浮顆粒物的含量以及湖水的富營養化程度等因素來定，在超富營養區的水樣中，細菌、藻類等浮游生物及其它懸浮雜質較多，每次可加入1mL左右的水樣;而來自富營養區的水樣，每次加入1.5mL左右;來自中等營養區的水樣，則要加入2mL左右，這樣才能使離心到銅網上的樣品分佈均勻、數量適中，能獲得較好的觀察效果。

　　用磷鎢酸對浮游病毒進行染色，只產生負染效應，由於它與支援膜的粘附作用很弱，染色後的標本不能久留，因此，常難以觀察到浮游病毒的精細結構，當我們選用醋酸雙氧鈾溶液作為染色劑時，由於醋酸雙氧鈾可產生正染和負染兩種效果，在銅網中雜質多、背景暗的區域可觀察到淺色的病毒顆粒;在淺色的背景下則可觀察到深色的病毒顆粒，因此，處理得當，就能有效觀察到不同背景條件下的浮游病毒顆粒，同時，醋酸雙氧鈾容易與支援膜粘附，產生較強的反差，染色後的標本較穩定，有利於儲存。

　　在建立了適宜浮游病毒制樣和染色方法的基礎上，獲得了不同病毒顆粒形態的圖片、病毒精細結構的圖片，這顯示所建立的方法，能簡便、有效地用於浮游病毒的研究，包括用於浮游病毒的計數分析。