動態光彈性法

[拼音]：shengwu yanghua

[英文]：biological oxidation

糖、脂肪、蛋白質等物質在生物體內通過酶的催化，實現的一系列釋能的化學反應過程。

生物界有近600種氧化還原酶參與生物氧化，在代謝物的轉換，能量代謝，物質解毒，神經介質與激素的作用以及固氮等方面起著重要的作用。這些酶大多位於各種生物膜上，如原核細胞的質膜內壁和間體膜上；真核細胞的線粒體內膜和內質網系膜等。其中線粒體含有三羧酸迴圈和氧化磷酸化酶系，能催化生成ATP，供細胞內各種化學反應與功能的能量需要，在生物氧化中具有最大的重要性。其他的生物氧化過程，有的不生成ATP，還有的如固氮酶催化鐵氧還蛋白的氧化，合成氨時要消耗ATP。

線粒體氧化磷酸化

線粒體內膜是電子傳遞鏈氧化磷酸化酶系所在部位，包括電子傳遞鏈（也稱呼吸鏈），偶聯磷酸化系統與內膜的傳送系統。糖、脂肪、氨基酸的氧化主要通過三羧酸迴圈使還原型的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）以及一些含核黃素輔基的脫氫酶的底物通過電子傳遞鏈而被氧化。氧化與磷酸化偶聯生成 ATP。ADP、ATP、無機磷酸以及一些底物通過內膜傳送系統進入或輸出線粒體，保證了氧化磷酸化的正常進行。

電子傳遞鏈

包括三類組份:脫氫酶、輔酶Q與細胞色素，它們都與內膜磷脂相互作用，蛋白質與磷脂在膜上生成的複合物是電子傳遞鏈的功能單位。一般認為電子傳遞途徑可用下式表示，α-甘油磷酸、膽鹼、脂醯輔酶 A可以分別通過相應的脫氫酶在相當於琥珀酸脫氫酶的位置與電子傳遞鏈聯絡（圖1）。

上述和呼吸鏈聯絡的脫氫酶都含有核黃素輔基，輔基在電子傳遞過程中被還原與氧化。琥珀酸脫氫酶位於線粒體內膜的內側，當用正丁醇抽提或鹼處理時它就從膜上脫落而溶於溶液中。溶液中的琥珀酸脫氫酶可以與不含琥珀酸脫氫酶的線粒體內膜小泡重組合。琥珀酸脫氫酶的抑制劑有草醯乙酸、丙二酸、硫茂甲醯基三氟丙酮(TTFA)等，後者只抑制膜上的琥珀酸脫氫酶，不抑制溶液中的琥酸脫氫酶。膜上琥珀酸脫氫酶與其他2～3個蛋白質一起構成複合物Ⅱ，後者催化琥珀酸氧化，輔酶Q還原。因此複合物Ⅱ也稱琥珀酸-輔酶Q還原酶。

NADH脫氫酶位於線粒體內膜內側，以核黃素單核苷酸為輔基，與內膜緊密結合。提純的可溶性NADH脫氫酶分子量約為7萬，含有4原子鐵與4原子硫。在膜上NADH脫氫酶與幾個含有鐵硫的蛋白質以及一些未知功能的蛋白質一起構成複合物Ⅰ，催化NADH氧化，輔酶Q還原。複合物中的鐵硫中心參與電子傳遞，經歷還原與氧化，它們也是一些抑制劑例如魚藤酮的作用點。

輔酶Q是醌的衍生物，也稱泛醌。是帶有寡聚異戊間二烯側鏈的苯醌衍生物。在不同種屬的生物體中泛醌的側鏈長短不同，人、豬等高等動物所含輔酶Q的側鏈是由10個異戊間二烯單位構成，稱為輔酶Q10或泛醌50，而在大鼠則為輔酶Q9。輔酶Q是高度疏水的，能在內膜疏水區中迅速擴散。電子傳遞鏈中含輔酶 Q的克分子數遠大於其他組份。如果用異辛烷或丙酮抽提去除輔酶Q，則NADH與琥珀酸均不能被氧所氧化，加輔酶Q又可以恢復電子傳遞鏈的功能（圖2）。

細胞色素是一類含有血紅素輔基的蛋白質。在電子傳遞鏈中電子經細胞色素 b、C1、c、aa3而到氧。細胞色素b、C1，鐵硫蛋白及其他蛋白質構成複合物Ⅲ，催化還原輔酶Q氧化，細胞色素c還原。目前已能把鐵硫蛋白從複合物Ⅲ中抽提出來然後再重組合到去除鐵硫蛋白的複合物Ⅲ上，恢復全部活力。

細胞色素aa3也稱細胞色素氧化酶，它由至少7個蛋白質亞基所組成，催化還原細胞色素c的氧化，在此過程中氧分子還原成水。一般稱細胞色素氧化酶為複合物Ⅳ，它含二個血紅素輔基與二個銅原子，銅也參與氧化還原過程。在膜上覆合物Ⅳ很可能形成二體。氰化物，疊氮化物與一氧化碳是細胞色素氧化酶的抑制劑。

電子傳遞鏈在膜上以複合物的形式存在。琥珀酸氧化酶活力即是複合物ⅡⅢⅣ的總的活力，NADH氧化酶活力即是複合物ⅠⅢⅣ的總的活力。如果把分離提純的複合物加上磷脂、輔酶Q與細胞色素c一起重組形成膜結構，可以再現琥珀酸氧化酶或NADH氧化酶的活力。

電子傳遞鏈的成分大多有特徵性的光吸收。這種光吸收隨著某一成分的氧化還原狀態的改變而改變，據此可以測定它們的含量以及在電子傳遞過程中的氧化還原的動力學變化。

氧化磷酸化

底物通過電子傳遞鏈氧化同時從 ADP和無機磷酸合成 ATP，這一過程稱為氧化磷酸化。這條途徑是動物細胞能量的主要來源。NADH的氧化還原電位為-0.32伏，因此NADH被氧氧化的標準自由能變化△Gó為-52.6千卡/克分子。在標準狀態下合成ATP需要消耗7.3千卡／克分子。根據測定，一分子NADH經電子傳遞鏈氧化可以合成三分子ATP，也就是說NADH氧化的P/O比值或P／2e比值為3。NADH氧化所生成的3個ATP是分別在複合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ偶聯得到的。琥珀酸氧化的P/O比值為2，分別生成於複合物Ⅲ、Ⅳ這二個偶聯部位。葡萄糖在體內氧化成二氧化碳和水時，標準自由能變化是-686千卡/克分子，每克分子葡萄糖可以生成38克分子ATP、即葡萄糖氧化合成ATP的熱功效率在標準狀態下是38％。但是由於ATP、ADP和無機磷酸在體內的相對濃度不是處於標準狀態，在生理狀態下合成ATP的自由能變化約為-12千卡/克分子，因此由葡萄糖氧化合成ATP的實際熱功率約為66％。

細胞內氧化反應是受細胞能量需要所控制的，當線粒體內的ADP全部被磷酸化生成ATP後，電子傳遞鏈即受抑制。因此ATP的生成有賴於電子傳遞，電子傳遞也有賴於對磷酸化的要求，氧化與磷酸化是緊密偶聯的。一般用呼吸控制率來表示偶聯的緊密程度，呼吸控制率是線粒體在高底物濃度，高ADP濃度下的呼吸速度對線粒體在高底物濃度，沒有外加ADP時呼吸速度的比值。心肌線粒體呼吸控制率一般可達8～10以上，肝臟線粒體可達4左右。

有些化學藥物可以使緊密偶聯的電子傳遞不必依賴ADP的存在而進行，加入ADP也不能生成ATP，這些化學藥物稱解偶聯劑。它們通常並不影響電子傳遞，但都具有增加線粒體內膜對質子的通透性的能力，常用的解偶聯劑有：羰基-氰-對-三氟甲氧基苯腙(FCCP)，2，4-二硝基苯酚等。

有些化學藥物抑制由ADP生成ATP的磷酸化作用，由於氧化與磷酸化的緊密偶聯，也就抑制了由ADP所刺激的氧化過程，這些化學藥物稱氧化磷酸化抑制劑。它們作用於線粒體內膜上的 ATP酶複合物。氧化磷酸化抑制劑對呼吸的抑制可被解偶聯劑解除。常用的氧化磷酸化抑制劑有：寡黴素，二環己基碳二亞胺(DCCD)等。

線粒體內膜ATP酶可以分成F0與F1兩部分，也有人稱ATP酶為複合物V。在此複合物催化 ATP水解的同時質子由線粒體內轉移到線粒體外。在正常呼吸情況下，底物的氧化造成線粒體膜外側質子濃度高於內側，此時質子通過這個複合物由線粒體外進入線粒體內從而推動了酶的逆反應，也即從ADP與無機磷酸合成ATP。

氧化磷酸化作用原理一直是研究氧化磷酸化作用的焦點，30多年來各種學說可以歸納為3種，化學偶聯學說是最早提出的。主要是借鑑3-磷酸甘油醛脫氫酶在脫氫氧化時偶聯磷酸化的機制，認為電子傳遞時先生成不含磷的高能中間物，再轉移成含磷的高能中間物，最後生成ATP。構象偶聯學說主要是受了肌肉收縮機制的啟發，一方面ATP會引起肌球蛋白構象變化產生肌肉收縮，另一方面收縮的甘油化的肌纖維的伸展會導致 ATP的合成。根據構象偶聯學說，電子傳遞釋放出的能量貯存於蛋白質肽鏈的摺疊中。至今沒有支援以上兩種學說的確切證據。

1961年英國P.D.米切爾提出化學滲透偶聯學說，認為電子傳遞過程起質子泵的作用，使線粒體內的質子穿過線粒體內膜到線粒體外，形成內膜二側的質子梯度，線粒體內膜上ATP酶複合物利用質子梯度的能量由ADP與無機磷酸合成 ATP。化學滲透偶聯學說很好地解釋了為什麼氧化磷酸化有賴於完整的膜結構，也說明了解偶聯劑的作用是由於它們在膜中起了質子載體的作用從而消除了膜兩側的質子梯度。至於氧化磷酸化的呼吸控制是質子梯度對電子傳遞的抑制。

三種偶聯學說之間的不同，是在於對電子傳遞釋放出來的能量貯存形式的看法不同。雖然目前對於電子傳遞如何產生質子移位還不完全清楚，但是化學滲透偶聯學說能較好地解釋大多數實驗結果，是目前多數人所接受的學說。

線粒體內膜的傳送系統

線粒體內膜是離子及一些物質如蔗糖等的通透屏障。根據物質對內膜的通透性可以把物質分成三類，第一類不能通過線粒體內膜，包括Cl-、NO婣、Br-、NH嬃、NAD+、NADH、NADP+、NADPH、輔酶A及乙醯輔酶A、蔗糖、甘露糖、AMP、GMP、GDP、GTP等。第二類能自由通過線粒體內膜而不需要膜上存在傳送蛋白的，包括乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、水、氧、二氧化碳、氨。第三類是通過膜上專一的傳送蛋白而被內膜傳送的，包括三羧酸迴圈的底物、無機磷酸、ADP、ATP、β-羥基丁酸、乙醯乙酸、穀氨酸、門冬氨酸、脯氨酸、磷酸烯醇丙酮酸等。

線粒體內膜傳送系統中比較重要的有ADP、ATP載體、磷載體、二羧酸載體、三羧酸載體等。有的抑制劑作用於內膜傳送系統因而間接地抑制了氧化磷酸化。例如蒼朮苷抑制ADP、ATP載體，使ADP不能進入線粒體，ATP不能從線粒體送出，結果完整線粒體的氧化磷酸化由於缺乏ADP而被抑制。但是在亞線粒體制劑，由於它是內翻外的製劑，ATP酶複合物面向膜小泡的外面與溶液中的ADP直接接觸，蒼朮苷就不再抑制氧化磷酸化。巰基試劑能抑制磷載體等許多內膜上載體，說明巰基在內膜物質傳送上有重要的功能。

線粒體內膜的傳送系統溝通了線粒體與細胞質之間的物質交換。脂醯輔酶 A通過與肉毒鹼生成脂醯肉毒鹼而進入線粒體被氧化。ADP帶三個負電荷，ATP帶四個負電荷，在膜電位的影響下細胞質中ATP/ADP比值反較線粒體內高，這就有利於氧化磷酸化的進行以及細胞質中的需能反應。NADH不能通透線粒體內膜，細胞質中NADH不能被線粒體直接氧化。NADH可以通過線粒體內膜外側的甘油-3-磷酸脫氫酶(E.C.1.1.99.5)與細胞質中甘油-3-磷酸脫氫酶(E.C.1.1.1.8)的共同作用，得到氧化（圖3）。

內質網系膜上電子傳遞

內質網系膜含有不偶聯ATP合成的電子傳遞系統，在藥物解毒、不飽和脂肪酸的生成上起重要作用。

內質網系混合功能氧化酶(E.C.1.14.14.1)

肝臟內質網系膜催化許多不同底物的羥化反應包括:甾體、藥物、致癌物、脂肪酸等。這個酶的活力是可被誘導的，它包括兩個部分：

（1）NADPH-細胞色素c還原酶。這是一種含核黃素輔基的脫氫酶(E.C.1.6.2.4)分子量約79000，含有一分子核黃素腺嘌呤二核苷酸與一分子核黃素單核苷酸。它的天然受體是細胞色素P450；

（2）細胞色素P450是一種末端氧化酶，由鐵原卟啉X為輔基，含有底物結合部位與氧結合部位。細胞色素P450從NAD-PH-細胞色素 c還原酶接受電子，催化分子氧中的一個原子進入底物，另一個原子還原成水。細胞色素 P450的多形性決定了混合功能氧化酶的多形性。不同細胞色素P450的分子結構不同，底物專一性也不同。

NADH-細胞色素b5還原酶(E.C.1.6.2.2)

是一種含核黃素腺嘌呤二核苷酸輔基的脫氫酶，它不能用細胞色素c作為受體，分子量44200、整個分子結構分為二部分，疏水部分含近100個氨基酸殘基，插入內質網系膜中，親水部分含有酶的活性部位。細胞色素b5被還原後把電子交給對氰化鉀敏感的一種末端氧化酶，在氧的參與下飽和脂醯輔酶A脫氫生成不飽和脂醯輔酶A。

內質網系膜上的上述二個電子傳遞系統是互相聯絡的。NADPH通過NADPH-細胞色素c還原酶可以還原細胞色素b5。由於內質網系膜上 NADPH-細胞色素c還原酶與細胞色素P450的比為1:50，也有可能還原性細胞色素b5可以還原細胞色素P450。

過氧化酶體

過氧化酶體是由單層膜包圍的細胞器，含有與過氧化氫的生成與降解有關的酶，可催化一些底物的氧化。這些氧化過程不被氰化物抑制，也不與ATP的生成相偶聯。主要的氧化酶有:L氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶、醯基輔酶 A氧化酶等，它們在氨基酸、嘌呤代謝，脂肪酸β氧化上起重要作用。過氧化酶體中含有過氧化氫酶(E.C.1.11.1.6)，它是一種以鐵原卟啉X為輔基的氧化還原酶，含有四個分子量為60000的亞基，催化上述底物氧化所生成的過氧化氫分解為氧和水。