關於補骨脂平喘作用分析的論文
關於補骨脂平喘作用分析的論文
1材料與儀器
1.1動物
SD大鼠，70只，SPF級，雌雄各半，180g左右，合格證號：0012625，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。
1.2試劑
卵白蛋白批號：970612上海化學試劑公司；氫氧化鋁乾粉批號：20020301-2廣州化學試劑廠；滅活百日咳桿菌（100億個/ml）廣東省中醫院提供；大鼠IL-4（批號20060620）、IFN-γ（批號20060620）ELISA試劑盒由晶美生物工程有限公司提供；IL-5（批號20983008）ELISA試劑盒由BanderMedsystems提供。
1.3補骨脂不同溶劑提取物補骨脂95%乙醇提取物浸膏，濃度：3.45g藥材/ml（簡稱浸膏）；補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物，濃度：10.0g藥材/ml（簡稱石油醚萃取物）；補骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物，濃度：6.67g藥材/ml（簡稱醋酸乙酯萃取物）；補骨脂95%乙醇提取水萃取物，濃度：10.0g藥材/ml（水萃取物）；補骨脂水提取物，濃度：10.0g藥材/ml（簡稱水提取物）；補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物，濃度：2g藥材/ml（簡稱甲醇洗脫物），以上試劑均由廣州中醫藥大學中藥學院提供。
1.4儀器酶標儀BIO-RADSModel550，日本；CSW-Ⅰ型超聲霧化器汕頭光電研究所；10L玻璃乾燥器。
2方法
2.1分組
將動物隨機分成7組，10只/組：哮喘模型組（給水，1.0ml/100g）、浸膏組（藥材0.9g/100g）、石油醚萃取物組（藥材2.5g/100g）、醋酸乙酯萃取物組（藥材1.7g/100g）、水萃取物組（藥材2.5g/100g）、水提取物組（藥材10.0g/100g）、甲醇洗脫物組（藥材2.5g/100g）。以上各組動物連續灌胃給藥治療10次，1次/d。末次治療後2h，各組動物心臟採血5ml，1000r/min離心15min，血清分裝（1ml/管）保存於－70℃低溫冰箱內待測：IL-4，IFN-γ，IL-5（嚴格按照ELISA試劑盒說明書分別檢測）。
2.2卵蛋白哮喘大鼠模型的建立
2.2.1大鼠致敏
上述分組中每隻動物腹腔注射抗原液0.5ml/100g(含卵蛋白100mg、氫氧化鋁乾粉100mg和2.5×109個百日咳桿菌/ml,製成懸濁液)［7］致敏第1次,次日每隻大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加強。
2.2.2激發和治療
首次致敏後第15天，於每天上午8～9時大鼠置於10L玻璃乾燥器內超聲霧化吸入2%卵蛋白20min激發哮喘,連續14d。激發後第4天起，於每天激發後大鼠口服給相應試劑治療（見“2.1實驗分組”）。正常組以生理鹽水取代抗原液按0.5ml/100g腹腔注射致敏大鼠，第2天以0.5ml/只腹腔注射生理鹽水加強；首次致敏後第15天，每天上午8～9時該組大鼠超聲霧化吸入生理鹽水20min激發哮喘,連續14d。激發後第4天起，於每天激發後大鼠口服給蒸餾水治療。
2.3統計分析結果
採用四川大學黃志勇主編的（PEMS3.0）《中國醫學百科全書·醫學統計學》統計軟體包進行統計：兩組均數比較t檢驗（方差齊）或t′（方差不齊）。
3結果
3.1補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IL-5含量的影響結果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物後，血清IL-5含量呈下降趨勢，其中補骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脫物各成分組大鼠血清IL-5含量降低明顯，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，差異有顯著意義。而石油醚和醋酸乙酯萃取物兩成分組大鼠血清il-5含量降低不明顯，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。
3.2補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IL-4含量的影響結果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物後，血清IL-4含量呈升高趨勢，其中補骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分組大鼠血清IL-4含量升高明顯，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清il-4含量升高不明顯，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。
3.3補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IFN-γ含量的影響結果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物後，不同溶劑成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致，其中補骨脂浸膏和石油醚萃取物兩成分組大鼠血清IFN-γ含量升高明顯，與哮喘模型組比較P<0.05，差異有顯著意義。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清IFN-γ含量減低顯著，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，有顯著性差異，而補骨脂水提對ifn-γ含量未見明顯影響，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。表1不同提取物對哮喘大鼠IL-5，IL-4，IFN-γ含量的影響(略)
3.4補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠Th1/Th2（IFN-γ/IL-5）的影響哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取組、甲醇洗脫物組和水提取物組的Th1/Th2比值依次為（n=10)：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5，0.8±0.4和1.2±0.5。提示，大鼠服用補骨脂醇提上述4種溶劑萃取物後，血清Th1/Th2比值呈增加明顯，與哮喘模型組比較P<0.05，差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物（0.4±0.2，n=10）和水萃取物（0.6±0.2，n=10）兩成分組大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明顯，與哮喘模型組比較P＞0.05，無顯著性差異。
4討論
哮喘與Th1細胞分泌的IFN-γ等細胞因子及Th2細胞產生的IL-4，IL-5等細胞因子含量和Th1/Th2比值密切相關。Th2的主要代表產物IL-4，能促進B細胞產生IgE，引發炎症介質釋放的鏈式反應，促進炎症細胞的趨化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水腫，平滑肌痙攣及粘液分泌亢進，是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表產物是IFN-γ，能抑制IL-4，IL-5等細胞因子的產生，進而抑制IgE的產生和Eos活性，抑制IAR和LAR，是哮喘免疫調節中的一個重要的抑制因子，許多細胞因子透過它發揮生物效應［8］。因此，採用IFN-γ，IL-5，IL-4作為哮喘敏感指標進行藥物篩選具有合理性。補骨脂是臨床上常用的補腎助陽中藥，具平喘之功，臨床上常用於虛寒喘咳［9］。補骨脂是今後應加強研究和開發的抗氣道抗炎症中藥之一［2］。我院從20世紀80年代初使用補骨脂注射液治療支氣管哮喘取得了理想的療效，但其作用的物質基礎並不清楚。因此，我們在前期研究的基礎上［2，3］，採用卵蛋白哮喘大鼠為模型，以體內血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量變化為指標，初步篩選補骨脂平喘作用的有效部位。
從IFN-γ含量變化來看，補骨脂95%乙醇提取物浸膏和補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明顯，可能是補骨脂平喘的主要成分，但從抑制IL-5和IL-4含量分析，補骨脂95%乙醇提取水萃取物和補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物對Th2細胞產生的IL-4，IL-5細胞因子有較強的抑制作用，其他成分卻升高或對IL-5，IL-4沒有顯著影響，而補骨脂水提取物對IFN-γ含量提高作用不明顯。另外，補骨脂95%醇提水萃取物顯著降低IL-5和IFN-γ含量，同時在給藥的過程中我們發現水萃取物的毒性明顯強於其他成分，這與其腎毒性是否相關值得關注。根據以上分析，我們初步推測補骨脂平喘有效部位應該主要是醇提成分：補骨脂95%乙醇提取物浸膏，補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脫物。
從哮喘中考察Th1/Th2的比值變化更具有意義［10］，因此我們以IFN-γ/IL-5為例，分析Th1/Th2的變化，探討補骨脂3個醇提成分（浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脫物）哪個為平喘的最佳有效部位。哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取物組和甲醇洗脫物組的Th1/Th2依次為（n=10）：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5和0.8±0.4，與哮喘組比較三者的P<0.05，差異有顯著意義，但醇提浸膏的比值更大。因此結合前面的分析，我們認為三者的`平喘作用大小依次為：補骨脂95%乙醇提取物浸膏>補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物=補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。
【參考文獻】
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［10］鄧時貴，韓凌，李偉英.總香豆素對卵蛋白致敏哮喘大鼠血清Th1/Th2的影響［J］.中國現代實用醫學雜誌，2005，4(8)：1.