深究DP2干預對大鼠海馬神經元的作用論文

　　鋁為地殼中含量最豐富的金屬元素，人類日常生活中應用廣泛，主要透過食物、化妝品及建築材料等途徑攝入。經證實，長期攝入大劑量鋁會產生嚴重中樞神經系統毒性，表現為行為和認知功能障礙、神經元損傷，甚至神經退行性變，但其具體機制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一類多不飽和脂肪酸衍生物，由環氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代謝產生，介導一系列生理病理過程。前列腺素D2(PGD2)是大腦中最豐富的PGs，其合酶(PGDS)有腦型PGDS(L睵GDS)和生血型PGDS(H睵GDS)兩種亞型。在中樞神經系統，除少突膠質細胞外，L睵GDS高表達於神經元。PGD2與特異性受體DP1和DP2結合後，透過受體介導的訊號傳遞機制而發揮廣泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶聯受體，分別偶聯Gs和Gi蛋白，影響環磷酸腺苷(cAMP)水平而發揮不同作用。有研究報道，在PGD2 致原代大鼠皮層神經元損傷模型中，DP2 拮抗劑BAY瞮3405未發揮保護作用，推測DP2 可能不介導PGD2 的神經毒性。另也有研究報道，在穀氨酸致原代大鼠海馬腦片損傷模型中，DP2激動劑DK睵GD2明顯升高神經元的LDH漏出率及細胞死亡率，提示DP2介導PGD2的神經毒性。出現此矛盾結果，可能與研究模型不同有關。DP2作為DP受體中的一員，在鋁鹽致原代培養大鼠海馬神經元損傷過程中具體是如何變化的，尚未見報道。目前廣泛研究的DP2選擇性激動劑主要有DK睵GD2、15d睵GD2、15d睵GJ2，DP2 選擇性拮抗劑主要有CAY10471、AM461、AZD1981。參考Yue等的報道，我們選擇DK睵GD2、CAY10471作為干預藥物進行實驗。我們前期實驗結果表明，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷模型中，L睵GDS表達明顯上調，DP2表達明顯下調，PGD2 含量明顯升高，初步提示L睵GDS睵GD2睤P2訊號通路可能參與了神經元損傷過程。在本實驗中，我們採用DP2選擇性激動劑和拮抗劑分別干預鋁負荷神經元，進一步觀察DP2在原代培養大鼠海馬神經元中的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 實驗動物選取孕期18d左右的SD大鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證書號：SCXK(渝)2012-0002。

　　1.1.2 主要試劑與儀器麥芽酚(阿拉丁，上海)，DMEM/F12、D睭ank′s(Hyclone，美國)，B27、Neuro瞓asal培養基、胎牛血清(Gibco，美國)，左旋多聚賴氨酸、MTT試劑盒(Sigma，美國)，青黴素-鏈黴素溶液、LDH試劑盒、Fluo3AM(碧雲天，上海)，山羊抗兔特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(博士德，武漢)，SP試劑盒、DAB顯色劑(中杉金橋，北京)，蘇木精染液、伊紅染液(南京建成，南京)，DK睵GD2、CAY10471(Cayman，美國)，超淨工作臺(蘇州淨化裝置有限公司)，二氧化碳培養箱(ThermoSci瞖ntific，美國)，超純水系統(Millipore，美國)，低溫冷凍離心機(ThermoScientific，美國)，鐳射掃描共聚焦顯微鏡(Bio睷ad，美國)，全自動酶標儀(BioTek，美國)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠海馬神經元原代培養取孕期18d左右的SD大鼠，斷頸後迅速剪開腹部皮膚和腹膜，將子宮完全暴露後剪斷肌層和臍帶，取出胎鼠並立即浸泡於裝有75%乙醇的燒杯中。約30s後，將消毒好的.胎鼠移入事先準備的D睭anks液中，斷頭取腦，迅速分離出兩側完整海馬，放入冰浴的D睭anks液中，用眼科剪將海馬組織剪碎。加入組織體積5倍左右的0125%胰酶，混勻，37℃培養箱內消化，10min時拿出輕輕吹打數次。20min後，加入同體積的含10%胎牛血清培養液終止消化。200目細胞網篩過濾，收集細胞懸液，800r·min-1離心10min。棄去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培養液重懸細胞，製成細胞密度為1×106·L-1的細胞懸液。吸取不同體積細胞懸液分別接種於左旋多聚賴氨酸包被好的培養板、培養皿及培養瓶中，置於37℃、5% CO2的培養箱中培養。4h後，待神經元貼壁，換含2% B27的Neurobasal培養液繼續培養，以後每隔3d半量換液1次。海馬神經元培養至d7時長到較好狀態，可進行後續實驗。

　　1.2.2 原代培養大鼠海馬神經元的免疫化學鑑定取6孔培養板中培養至d7的海馬神經元爬片(10mm×10mm)，棄去細胞培養液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次2min;3% H2O2 孵育15min，PBS漂洗3次，每次2min;10%山羊血清封閉，37℃孵育20min，吸乾血清，不漂洗;NSE多克隆抗體∶抗體稀釋液(1∶50)，以PBS代替一抗設空白對照，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5min;生物素標記山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;辣根酶標記鏈黴素卵蛋白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;避光條件下，DAB顯色10min，自來水終止反應;蘇木精染液復染細胞核，3min後自來水返藍;95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;晾乾，鏡下觀察。

　　1.2.3 MTT測定將96孔培養板中大鼠海馬神經元培養至d7進行實驗分組，即空白對照組(300μmol·L-1maltol)、鋁負荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預組(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素後繼續培養24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1)，37℃培養箱中孵育4h。棄去孔內上清液，加入150μLDMSO，搖床上避光震盪，以充分溶解結晶物，於570nm波長處測定吸光度值(OD值)。

　　1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定將24孔培養板中大鼠海馬神經元培養至d7進行實驗藥物處理(分組同“1.2.3”)，繼續培養24h後，根據LDH測定試劑盒說明書具體步驟操作，於490nm波長處測定OD值。計算公式：細胞毒性或LDH漏出率/% =(處理樣品OD值-樣品對照孔OD值)/(細胞最大酶活性的OD值-樣品對照孔OD值)×100。

　　1.2.5 海馬神經元病理形態學觀察將24孔培養板中大鼠海馬神經元爬片(10mm×10mm)培養至d7進行實驗分組，即空白對照組(300μmol·L-1mal瞭ol)、鋁負荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預組(Al3+ +10-5mol·L-1DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素後繼續培養24h，棄去細胞培養液，PBS漂洗3次，每次1min;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次;HE染色，鏡下觀察。

　　1.2.6 Ca2+熒光強度測定將共聚焦專用培養皿中大鼠海馬神經元培養至d7進行藥物處理(分組同“1.2.5”)，繼續培養24h。棄去培養皿中培養液，採用Ca2+熒光探針Fluo3/AM標記活細胞內Ca2+，透過鐳射掃描共聚焦顯微鏡測定細胞內Ca2+熒光強度。1.2.7 統計學分析所有實驗結果均以珋x±s表示，採用SPSS17.0統計軟體進行分析，組間比較採用單因素方差分析及Dunnett′st檢驗。

　　2 結果

　　2.1 原代培養大鼠海馬神經元NSE免疫化學鑑定培養至d7的神經元，在倒置光學顯微鏡下觀察，其胞體飽滿有光暈，軸突和樹突明顯，突起交錯連線成網狀。經NSE免疫細胞化學染色後，陽性細胞胞體及突起呈棕黃色;蘇木精復染後，陽性細胞胞核呈藍色。隨機取6個視野，每個視野挑選100個細胞，計數NSE陽性細胞並計算其所佔百分比。統計結果顯示，超過95%為陽性細胞(Fig1)。

　　2.2 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響

　　2.2.1 DK睵GD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2干預組MTT值明顯降低，且有劑量依賴性。

　　2.2.2 CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組MTT值明顯升高，且有劑量依賴性。

　　2.3 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響

　　2.3.1 DK睵GD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2 干預組LDH漏出率明顯升高，10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1組差異有顯著性(P<001。

　　2.3.2 CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組LDH漏出率明顯降低(P<001)。

　　2.4 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元病理形態學的影響 HE染色後，在正置光學顯微鏡下觀察，空白對照組海馬神經元結構清晰完整，胞體呈錐形或三角形，核仁明顯，有雙極或多極突起並相互交織成網;鋁負荷模型組海馬神經元細胞數目明顯減少，突起萎縮，部分細胞核固縮;DK睵GD2干預組海馬神經細胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預組海馬神經元較模型組神經元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少(Fig2、3)。

　　2.5 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元Ca2+熒光強度變化的影響空白對照組海馬神經元的Ca2+熒光強度極其微弱，鋁負荷模型組Ca2+熒光強度明顯增強(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2干預組Ca2+熒光強度有增強趨勢，但差異無顯著性;CAY10471干預組Ca2+熒光強度明顯降低(P<001)(Tab5、Fig4)。

　　3 討論

　　鋁作為一種公認的神經毒劑，過量蓄積可嚴重影響人的認知功能，進而誘發一系列神經系統疾病。與三氯化鋁、葡萄糖酸鋁等其他鋁鹽相比，麥芽酚鋁[Al(malt)3]是一種中性含鋁複合物，在生理pH條件能釋放出大量Al3+，有利於進行鋁負荷神經毒性的相關研究。本實驗採用Neurobasal培養基(含2% B27)進行海馬神經元的原代培養，透過神經元胞質內特異性標誌物NSE的鑑定，其純度超過95%。參考Chen等[11]並透過我們的前期實驗摸索，本實驗採用100μmol·L-1麥芽酚鋁建立鋁負荷大鼠原代海馬神經元損傷模型。研究結果發現，與空白對照組比較，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強度明顯增強，海馬神經細胞數目明顯減少、突起萎縮，部分細胞核固縮。Chen等[12]對麥芽酚鋁致原代培養的大鼠皮層神經元損傷進行了研究，發現Al3+透過啟用Rho睷ock訊號通路誘導神經毒性。Johnson等[13]在原代培養的大鼠海馬神經元中發現，麥芽酚鋁可造成神經元呈時間和劑量依賴性凋亡，其作用機制可能與麥芽酚鋁抑制腦源性神經生長因子(BDNF)，導致細胞內Ca2+升高有關。

　　我們實驗結果還發現，與鋁負荷模型組相比，DK睵GD2干預組MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強度有增強趨勢，海馬神經細胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預組MTT值明顯升高、LDH漏出率明顯降低、Ca2+熒光強度明顯減弱，海馬神經元較模型組神經元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少。有研究報道，DP2 偶聯Gi蛋白，透過啟用磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145)，啟用糖原合成酶3(GSK3)，活化T細胞核因子的轉換，釋放炎性介質。也有研究報道，DP2被啟用後偶聯Gi蛋白，抑制cAMP水平，促進Ca2+ 內流，上調CD11b表達，誘導嗜鹼性粒細胞遷移和脫顆粒，促進IL2、IL4、IL5、IL13的釋放。Liang等[5]對天冬氨酸(NMDA)致原代海馬神經元損傷進行了研究，發現DK睵GD2 加重神經元損傷。Schroder等[16]對炎性相關因子前列腺素H1(PGH1)進行了研究，發現CAY10471可抑制Th2細胞的遷移。結合本實驗結果，DK睵GD2可能透過激動DP2，偶聯Gi蛋白，增加細胞內Ca2+濃度，加重鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷;CAY10471可能透過抑制DP2活性，減少Ca2+流入，對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷起一定保護作用。

　　綜上所述，DP2 啟用表達可增加神經元對鋁鹽損傷的易感性，其機制可能涉及DP2下游Ca2+訊號通路的調控，但由於作用複雜，在神經系統中的機制尚不完全清楚。因此，在本研究的基礎上，可對DP2在神經系統中介導的下游Ca2+訊號通路的具體調控機制進行深入研究。