紫心甘薯多糖的分離及組分抑癌活性研究的論文

　　天然活性多糖是一類結構複雜的生物大分子物質，作為植物細胞壁的結構成分廣泛存在於自然界中，具有機體免疫調節、抗氧化、降血糖血脂等作用近年來，多糖研究日益受到人們的關注。目前，實驗室常用熱水浸提和低溫鹼提兩種方法來獲得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，採用熱水浸提所得的天然植物多糖（如人參多糖）經純化在體內外均具有一定的抗腫瘤活性0,也有報道紫心甘薯水提粗多糖在體內有一定的抑瘤效果,但尚未見到關於紫心甘薯多糖分離及組分抑癌研究的相關報道。本研究結合浙江省臨安市太陽鎮紫心甘薯基地的開發課題，以紫心甘薯“渝紫263”為材料,透過低溫鹼提獲得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖組分的分離條件,並藉助體外細胞實驗和紅外光譜等檢測手段初步探究紫心甘薯多糖的結構成分及組分的抑癌作用，為進一步開發和利用紫心甘薯提供理論指導和實驗依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1實驗材料與試劑紫心甘薯，由浙江省臨安市太陽鎮紫心甘薯實驗基地提供;腫瘤細胞株Hela、HepG:,由浙江大學醫學院提供；DEAE-Cellulose,華東醫藥試劑；CM-Cellulose,華東醫藥試劑；SephacrylS-t00,美國GE公司;D-葡萄糖醛酸，國藥集團試劑；咔唑，中國遠航試劑;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（臨用時用PBS配置成5mg/ml溶液，分裝避光-20°C儲存）；DMSO,Sigma公司；

　　標準單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、濃硫酸、甲苯胺藍等試劑均為國產分析純。

　　1.1.2主要儀器AKTAprimeplus層析系統，美國GE公司；LDR44.4C低速冷凍離心機，北京醫用離心機廠；高速冷凍離心機,BECKMANCOULTER；可見分光光度計，上海稜光技術有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；電子天平，德國IKA;磁力攪拌器，IKARHbasicl;紅外光譜儀470FT-IR,NEXUS公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS；二氧化碳培養箱，美國FormaScientific公司；516MC酶標儀，國產;各種尺寸層析柱，上海華美實驗儀器廠;薄層層析矽膠板,浙江台州；真空乾燥裝置,上海一恆科技有限公司；層析缸，國產。

　　1.2方法

　　1.2.1紫心甘薯多糖提取參見文獻0。甘薯洗淨、去皮、烘乾後粉碎；用3倍體積95%乙醇於80C水浴中迴流脫脂2h,重複一次，晾乾後在70C水浴中水提2h,離心分離上清液,殘渣重複操作一次;合併上清液，濃縮,三氯乙酸法除蛋白，用3倍體積85%乙醇沉澱多糖；無水乙醇、丙酮反覆洗滌；將沉澱在低溫下用10%NaOH以1:10的比例進行鹼提，濃縮，蒸餾水透析48h;用3倍體積85%乙醇沉澱多糖；離心取沉澱，用無水乙醇反覆洗滌；真空烘乾後得PPSP粗多糖。

　　1.2.2多糖標準曲線繪製苯酚4硫酸法檢測糖含量，以葡萄糖為標準單糖,繪製葡萄糖標準曲線;硫酸咔唑法檢測糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸為標準品,繪製糖醛酸含量測定標準曲線。1.2.3離子交換層析參見文獻_。離子交換柱的選擇：配置0.05mol/LPBS緩衝液（K2HPO4-CH2PO4),再用此緩衝液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纖維素微孔濾膜過濾，超聲脫氣30min。將處理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分別裝柱（2.6X30cm),用3倍柱體積的緩衝液平衡。取PPSP粗多糖，用去離子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分別上樣10ml,待吸附30min後，用相同體積的去離子水分別洗脫,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法檢測,記錄並作洗脫曲線。

　　洗脫液pH的選擇：選用上述吸附效果較好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分別溶於10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS緩衝液中，經0.45^m濾膜過濾，緩慢上樣，吸附30min後，用200ml對應pH緩衝液洗脫，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法檢測，記錄並作洗脫曲線。

　　洗脫方式的選擇：確定交換柱與pH緩衝體系之後，探究不同洗脫方式對PPSP洗脫效果的`影響。取5mg/ml多糖溶液10ml,濾膜過濾,緩慢上樣，吸附30min。先後分別用蒸餾水、0.05mol/LpH7.6的PBS緩衝液結合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脫。流速1.0ml/min,每管10ml,分別收集。苯酚~硫酸法測定,作洗脫曲線，合併主要峰，透析除鹽，濃縮，冷凍烘乾待用。

　　1.2.4多糖收集和檢測利用美國GE公司蛋白純化儀自動收集器收集離子交換層析的洗脫液,採用苯酚4硫酸法跟蹤檢測各PPSP多糖組分（od490),以管號為橫座標，吸光值為縱座標繪製洗脫曲線，收集同種多糖組分。雙蒸水透析48h,每12h換一次水,磁力攪拌。透析完畢,冷凍乾燥得各多糖組分。

　　1.2.5凝膠過濾層析將處理好的SephcrylS400裝柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分離得到的樣品溶於0.05mol/L的NaCl溶液中，濾膜過濾後取5ml緩慢上樣，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脫，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法檢測,作洗脫曲線圖。

　　1.2.6薄層層析樣品處理:取紫心甘薯多糖樣品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸鋇中和，離心去沉澱。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等標準單糖做同樣處理。待矽膠板活化後，用毛細管進行點樣。展層劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;顯色劑:苯胺4卩苯二甲酸。

　　1.2.7紅外光譜鑑定取約1mg已純化的PPSP多糖組分樣品，與適量KBr粉末在白熾燈下乾燥磨混均勻，壓片機壓片，採用傅立葉變換紅外光譜儀在4000cm-1~400cm-1區間掃描。

　　1.2.8MTT法檢測PPSP多糖組分對Hela和HepG2腫瘤細胞的體外抑制作用參見文獻。取對數生長期的Hela和HepG細胞，分別用胰蛋白酶消化後接種於96孔板中。設定不同PPSP多糖組分濃度的實驗組，將標準葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三種多糖組分臨用前用PBS配置成終濃度為10、20、40、80^g/ml溶液,紫外滅菌。每個實驗組的各濃度梯度組,每孔加上述多糖組分溶液20空白對照組加入相同體積的PBS,每組設4個復孔，置於37C,5%CO2培養箱培養。在加樣後第24、8、96h時各取一塊96孔板，加入20^lMTT溶液繼續培養4h。小心吸盡培養液，加入200^lDMSO,震盪,使藍紫色結晶物充分溶解,於490nm波長下測各孔吸光度。腫瘤細胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A實驗組/A空白對照組）x100%。

　　1.3資料處理採用SPSS18.0進行資料處理和分析,實驗資料取三次平均值,採用方差分析（F檢驗）,有顯著差異時，再作共同對照t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2結果與分析

　　2.1多糖提取及標準曲線經鹼提法獲得紫心甘薯粗多糖,經計算其得率為31.72%;檢測到樣品中糖含量為55.4pg/ml,糖醛酸含量為

　　11.51^g/ml；實驗得出葡萄糖標準曲線為：A=0.5C-0.005(R=0.9986),糖醛酸標準曲線為：A=0.0053C(R2=0.9991)。

　　2.2離子交換層析

　　不同型別弱離子交換柱選擇在一定條件下，分別經DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱和CM-Cellulose弱陽離子柱父換洗脫，洗脫圖見圖1。圖1(a)的洗脫峰基本對稱,峰形較規則;相比之下，圖1(b)的洗脫峰較寬，無對稱性且分佈不均勻。推測DEAE-Cellulose柱對PPSP多糖的選擇吸附性要比CM-Cellulose柱好，因此本實驗選用DEAE-Cellulose柱分離PPSP多糖。2.2不同pH緩衝液選擇PPSP多糖經不同pH值的PBS緩衝液洗脫得洗脫圖，見圖2。多糖是一類多羥基聚合物，中性或酸性多糖容易在鹼性條件下被弱陰離子交換柱吸附。從圖

　　2(a)分析可知,pH7.2的緩衝液洗脫時並沒有出現對稱峰形,繼續洗脫得到拖尾峰。圖2(b)顯示,pH7.6的緩衝液在洗脫體積為100ml時開始出峰,且峰形對稱、均一、含量較大。結合圖2(c)和圖2(d)分析,洗脫液鹼性條件(pH大於8.2)對PPSP多糖分離不利，因此PPSP多糖分離的最佳洗脫緩衝液pH值為7.6。

　　2.2.3洗脫方式最佳化在pH7.6的條件下,將PBS緩衝液結合NaCl溶液進行0~1mol/ml濃度範圍的線性洗脫（圖3)。可以看出，第一個PPSP多糖組分分離完全,但繼續洗脫後並沒有將剩餘多糖組分很好地分離。推測線性洗脫時低鹽濃度對PPSP的分離有效，高濃度鹽溶液不適用於該多糖的分離。

　　與線性梯度洗脫相比較，分段洗脫更適用於不同多糖組分間的分離，峰形陡而尖且相對

　　完整,見圖3。收集四個多糖組分吸收峰，分別命名為ppspI、ppspn、ppspm和ppspw。前三個多糖組分的含量相對較高，經過SephcrylS-400凝膠柱後得到了單一對稱峰,純度較好。

　　根據以上實驗結果，本實驗選用以下條件來進行PPSP多糖的離子交換色譜分離：弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose；在pH7.6的0.05mol/LPBS緩衝液（I(2HPO44CH2PO4)體系下,採用200mlPBS緩衝液、200ml0.1mol/LNaCl溶液、300ml0.3mol/LNaCl溶液和100ml0.5mol/LNaCl溶液進行分段洗脫。

　　1.3薄層層析結果完全酸水解的紫心甘薯多糖PPSPI、PPSPH、PPSP1,二次層析結果分析多糖組分的單糖組成為:PPSPI主要由葡萄糖和半乳糖組成，ppspn主要由葡萄糖組成;ppspm沒有檢測到結果，分析可能與其糖蛋白成分干擾有關。

　　2.4紅外光譜結構分析ppsph的紅外光譜圖（圖4):881cm-1的峰表明PPSPH中的糖苷鍵為P型（a型糖苷鍵的吸收峰在890cm-1左

　　右處）。1097cm-1和1041cm-1的吸收峰表在1384~1076cm-1具有明顯特徵吸收峰），示PPSPH中的糖環構型為吡喃型（呋喃型糖環表明PPSPH具有P~D-葡萄吡喃聚糖的特徵吸收峰。

　　PPSP1的紅外光譜圖（圖5)：在3422cm-1附近有O-H伸縮振動的強吸收峰，1630cm-1可能是~CHO中C=O的伸縮振動,這兩組峰是多糖的特徵吸收峰;1100cm-1可能是C4的彎曲振動峰,另外,在1425cm-1具有較弱的吸收峰，為蛋白質特徵吸收峰。因此，推測ppspm可能為糖蛋白。

　　1.5多糖組分對腫瘤細胞株Hela和HepG:的體外抑制作用PPSPn組分對Hela和HepG2腫瘤細胞株的體外抑制效果如圖6所示,PPSPH對Hela和HepG:細胞在體外具有一定的抑制作用，並呈劑量依賴效應。從圖6(a)中可看出，10ag/ml劑量組在48h時達到最大,然後

　　開始下降,20ag/ml和40ag/ml劑量組在24h時達到最大,80ag/ml劑量組受到強烈抑制,細胞數量一直下降。從圖6(b)圖中可以看出,PPSPn組分

　　41.83%,61.45%,68.67%(P<0.01)。圖6(c)中顯示，不同濃度的ppspn組分作用下,20ag/ml,40ag/ml,80ag/ml劑量組均在48h時細胞活力達到最大，然後開始下降。從圖6(d)中可看出，PPSPH組分對HepG2細胞株在96h時均有較高的抑制率,分別為30.76%,36.83%,42.46%,48.53%(P<0.01)。

　　PPSP1組分對Hela和HepG2腫瘤細胞株的體外抑制效果如圖7所示,PPSP1對Hela和HepG2細胞在體外具有一定的抑制作用，並呈劑量依賴效應。從圖7(a)中可看出,20ag/ml和40ag/ml劑

　　量組在48h時細胞活力達到最大,80ag/ml劑量組在24h時細胞活力達到最大,然後開始下降。從圖7(b)中可以看出,40ag/ml劑量組在48h和96h的抑制率分別為34.50%和42.07%(P<0.05),80ag/ml劑量組在48h和96h時的抑制率分別為42.81%(P<0.05)和54.13%(P<0.01)。從圖7(c)中顯示，20ag/ml'40ag/ml'80ag/ml劑量組均在48h時細胞活力達到最大,然後開始下降。從圖7(d)中可得,40ag/ml劑量組在96h時抑制率為54.68%(P<0.05),80ag/ml劑量組在24h、48h和96h時抑制率分別為33.15%(P<0.05),41.86%(P<0.05)和71.08%(P<0.01)。

　　同時,本實驗在設計了PBS溶液作為空白對照組以外，還選取標準葡萄糖溶液作為實驗參考。實驗發現:加入標準葡萄糖溶液後，Hela和HepGi腫瘤細胞的生長趨勢與空白對照組相似,且相應同濃度的標準葡萄糖對兩種腫瘤細胞的抑制不明顯，不存在劑量依賴效應。

　　3討論

　　本實驗以浙江省臨安市太陽鎮紫心甘薯“渝紫263”為研究物件,低溫鹼提法獲得紫心甘薯多糖，在比較了ppsp多糖的弱陽離子和弱陰離子交換柱的洗脫分離效果後，選用DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱進行分離，獲得了4個多糖組分（PPSPI、PPSPn、PPSPM和PPSP^)。據國外研究報道13,中性多糖和酸性多糖常透過弱陰離子交換柱進行分離,低鹽濃度下洗脫得到中性多糖，而高鹽濃度下洗脫的多為酸性多糖；中性多糖可以進一步經凝膠過濾層析被分離成a-葡聚糖（吸附較強）和p肩聚糖（吸附較弱）。本實驗中發現,ppspI在低鹽濃度下最先被洗脫出來，且經檢測不含糖醛酸,推測PPSPI為中性多糖組分,PPSPH、PPSPM和PPSPW隨後被洗脫分離，推測為酸性多糖。紫心甘薯多糖組分的體外抑癌實驗結果表明，酸性多糖PPSPH和PPSPM在體外對Hela和HepGi腫瘤細胞株生長有一定的抑制作用，而中性多糖PPSPI無明顯的抑制效果。以上結果與文獻報道的天然活性多糖中酸性多糖對癌細胞生長有較明顯抑制效果的觀點相符M。

　　多糖組分的結構與其生物活性之間的關係一直是研宄的熱點和難點。天然活性多糖中含有豐富的中性多糖和酸性多糖，單糖間以糖苷鍵相連,有些單糖與蛋白質或脂質相連,構成糖蛋白或糖脂，這些不同的連線方式賦予了天然活性多糖抗腫瘤活性的良好結構基礎&443。本實驗從PPSP多糖對腫瘤細胞體外抑制實驗結果中初步表明“渝紫263”中所含的天然活性多糖中的PPSPH和PPSPM組分具有一定的體外抑癌活性，分析可能與它所含有的P~D-葡萄吡喃聚糖和糖蛋白成分有關。目前PPSPH、PPSPM組分的構效分析仍在深入研究中。