寄生線蟲遺傳多樣性的分子研究成果探析論文

　　生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性、生態系統多樣性和景觀多樣性。在生物多樣性這四個層次中，遺傳多樣性是核心內容和生物進化的基礎。遺傳多樣性是指同一物種內不同種群間或同一種群內不同個體間的遺傳變異的總和[1], 在種群間或種群內主要表現為分子、細胞和個體三個水平上的遺傳變異[2]. 通常來說 , 遺傳變異程度的高低是反映遺傳多樣性大小的最直接表達形式。在自然界中，種群是生物進化的基本單位，種群遺傳結構的差異也反映著遺傳多樣性的程度，所以遺傳變異的大小和種群遺傳結構的差異同時決定著一個物種的進化潛力和對不良環境的抵抗能力[3].

　　遺傳多樣性的研究有著重要的價值，可以為物種的進化提供理論支援，加深人們對生物起源的認識，同時為保護現有資源提供背景資料[4]. 對於寄生線蟲來說，每年由寄生線蟲引起的疾病，給家畜的健康和畜牧業的發展帶來嚴重的危害，這使得人們的研究不斷深入，從最初對寄生線蟲的形態學、系統分類學和生態學特徵等方面的描述，逐漸發展到遺傳特性、分子進化以及基因功能等方面的研究[ 5].

　　寄生線蟲種群遺傳學的研究可以在種群間或種群內進行，遺傳多樣性依賴於鹼基的突變率、種群的有效大小和種群的遷移率等[6]. 遺傳多樣性的研究對了解寄生線蟲的流行方式、抗藥性等位基因的擴散以及疾病的防控有著重要的意義。

　　1寄生線蟲遺傳多樣性的分子研究方法

　　遺傳多樣性的研究方法從傳統的形態學標記、染色體標記和生化標記逐步發展到DNA分子標記。DNA是遺傳物質的載體 , 遺傳資訊就是DNA的鹼基排序，直接對DNA鹼基序列的分析和比較是揭示遺傳多樣性的最理想方法。與其他標記相比， DNA分子標記不受發育階段和組織特異性的影響，多型資訊含量豐富，現已被廣泛應用到系統發育、基因定位和遺傳育種等研究中[7]. 此外 , DNA分子標記應用於研究種群遺傳多樣性時，不需要大量的表型遺傳基礎作為背景資料，為加快寄生線蟲的分子生物學研究、診斷分析和潛在疫苗的特徵描述提供了技術保障。

　　1.1 限制性片段長度多態性（ restriction fragmentlength polymorphism, RFLP） RFLP 標記是以分子雜交為核心的第1代分子標記技術。其基本原理是基因組DNA上的特定核苷酸序列可被限制性內切酶識別並切割，然後與探針結合進行Southern雜交，透過放射顯影的方法觀察所獲得的特異性RFLP圖譜[8]. 這種分子標記的出現 , 使得種群遺傳學的發展向前跨越了一大步，但是同位素標記的使用存在一定的放射性汙染，對於不同發育階段的個體差異分析，敏感性不高。隨著PCR技術的建立， RFLP常與PCR技術相結合應用於種群遺傳多樣性的分析中，既克服了上述方法的侷限性，也省去了酶切和雜交等繁瑣的操作過程，並且僅需少量的DNA模板[9]. PCR-RFLP的.原理是將擴增的PCR產物使用特異性的限制性內切酶切割成大小不同的片段，再利用凝膠電泳分辨其差異性。

　　1.2 隨機擴增多態性 DNA （ random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD） RAPD 技術最早出現於20世紀90年代，是以PCR為核心的第2代分子標記技術。使用該分子標記時不需要了解研究物件的DNA序列資訊 , 利用10個核苷酸的隨機寡核苷酸序列作為引物，對基因組DNA進行PCR擴增，根據凝膠電泳顯示的若干大小不一片段分析該物種的多型性[ 10,11]. 應用 RAPD 分子標記時所需 DNA 的量少 ,操作簡易，檢測速度快，可以檢測出RFLP標記不能檢測的重複序列區，填補RFLP圖譜的空缺，但是該分子標記重複性和特異性比較差[12].

　　1.3 聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性（polymerasechain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP） PCR-SSCP 標記是將 PCR 和 DNA 單鏈構象多型性結合的第2代分子標記技術。其原理是將擴增得到的 DNA 雙鏈產物變性處理成單鏈的DNA, 在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳中 , 根據電泳遷移率的不同，觀察單鏈DNA構象的差異，反映出物種的多型性[ 13]. 傳統的 SSCP 分析採用平板凝膠電泳，這不僅費時費力，還不能滿足大量篩選突變基因的需要。有研究者將毛細管電泳與SSCP結合替代了平板凝膠電泳[14], CE-SSCP標記具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少等特點， 20世紀80年代， CE-SSCP標記得到廣泛應用。

　　1.4 擴增性長度片段多態性（ amplified fragmentlength polymorphism, AFLP） AFLP標記也是第2代分子標記技術的一種，與RFLP標記不同的是該標記需要兩種限制性內切酶切割基因組DNA, 酶切片段的5′端在T4連線酶的作用下與帶有兩種內切酶黏性末端的接頭序列連線，接頭序列是由核心序列和內切酶識別序列兩部分組成，接頭序列與引物3′端選擇性鹼基識別，對特異性片段進行預擴增和選擇性擴增，在變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳上檢測PCR產物，尋找多型性片段[15]. AFLP 標記兼具了 RFLP和RAPD兩種標記的優點，但是操作比較複雜，花費較高。

　　1.5 微衛星DNA （microsatellite DNA, SSR）微衛星DNA 又被稱為簡單重復序列（ simple sequencerepeat, SSR）或者短串聯重複序列（ short tandemrepeat, STR） , 廣泛且隨機地分佈在真核生物的基因組中[16], 是由1~6個核苷酸為重複單元組成的串聯重複序列。微衛星DNA呈現出的高度多型性以自身重複單位數的差異為基礎，在DNA複製過程中出現滑鏈現象，使重複序列之間發生了插入和缺失等變化，出現了大量的不同的等位基因從而引起了微衛星DNA的高度多型性[17,18]. 微衛星DNA 是由核心序列與其兩端的側翼序列組成的，根據兩端保守的側翼序列設計PCR反應的引物，擴增出微衛星片段，用於遺傳多樣性的分析。目前，微衛星DNA被廣泛應用於種群遺傳結構分析、構建遺傳圖譜、親子鑑定和QTL定位等研究中。

　　1.6 線粒體DNA （mitochondrial DNA）寄生線蟲的線粒體基因組與後生動物的線粒體基因組相似，也呈環形，基因組大小在12~26 kb. 目前大約有110 種線蟲的線粒體基因組全部完成測序和分析 .線粒體基因組包括12~13個編碼基因，分別是煙醯胺脫氫酶亞單位1~6和4L基因、細胞色素氧化酶亞單位1~3和b基因、 ATP酶亞單位6或8基因 [除旋毛蟲（Trichinella spiralis）外，大部分線蟲的線粒體基因組不包括ATP酶亞單位8基因], 還包括tRNA基因和rRNA基因[19]. 線粒體基因組獨立存在於細胞核外，與核基因組相比進化速率快，有母系遺傳特徵並且能夠穩定遺傳[20], 常被應用在種群遺傳學的研究中，尤其是相對保守的cox1和nad4基因應用廣泛。

　　1.7 DNA 分子標記方法特徵的比較 DNA 分子標記可以分為兩大型別， I型是與分子標記相關聯的基因的功能是已知的， II型是與分子標記相關聯的基因功能是未知的[21]. DNA分子標記被廣泛應用於種群的遺傳學分析中，每種標記都有自身的優點和侷限性，常用的分子標記特點見表1.

　　2寄生線蟲遺傳多樣性的研究現狀

　　2.1 捻轉血矛線蟲（ Haemonchus contortus）線粒體DNA屬於核外基因，並且具有進化速率快、母系遺傳等優點，因此常被選作遺傳標記應用於捻轉血矛線蟲遺傳多樣性的研究中。國內外均有報道，以線粒體nad4基因作為遺傳標記，對寄生在牛羊體內的捻轉血矛線蟲的種群遺傳結構進行分析，包括美國、希臘、德國、瑞典、澳大利亞、印度尼西亞、柬埔寨、馬來西亞、葉門、巴西、中國和巴基斯坦等地區[22-27]. 這些研究均表明 , 捻轉血矛線蟲的遺傳變異大部分來自種群內部。其次，從全球範圍來看，來自距離相近的國家或同域的種群，種群間基因流動高，導致種群間遺傳分化程度不高；而對於不同地理起源的種群來說，受地理隔離的影響，種群間基因流動有一定的阻礙，使得種群間的遺傳分化程度相對較高。而以同樣基因作為遺傳標記分析寄生在野生動物體內的捻轉血矛線蟲的種群遺傳結構時，發現種群內部也表現出較高的遺傳變異[28].

　　國外研究者對捻轉血矛線蟲的微衛星DNA的結構特點也進行了研究，結果發現捻轉血矛線蟲的微衛星位點不屬於完美型，但捻轉血矛線蟲的微衛星標記的多型性比較豐富，可作為遺傳標記用於種群遺傳結構分析[29,30]. 利用8個微衛星位點分析捻轉血矛線蟲成蟲和3期幼蟲的遺傳多樣性，結果表明，在對大量的幼蟲DNA樣品進行遺傳學研究以及實驗室株和野生株之間的遺傳關係分析上，微衛星標記是一種簡便而又快速的手段[31]. 以11個微衛星位點作為遺傳標記，分析澳大利亞不同氣候和地理位置的捻轉血矛線蟲的種群遺傳結構，結果表明來自澳大利亞不同地理位置的種群表現出明顯的遺傳差異，同時也觀察到蟲體表型上的差異[32].

　　2.2 毛圓線蟲 Grant等[33]在1994年藉助RFLP分子雜交技術，使用簡單非重複性的探針對蛇形毛圓線蟲（Trichostrongylus colubriformis）的種群間和種群內的遺傳關係進行了分析，同時比較了蛇形毛圓線蟲的實驗室株和野生株之間的遺傳差異。研究發現實驗室株的多型性並不少於野生株，說明在相對規模小的種群內也能維持足夠的多型性。PCR-RFLP 標記也可應用於寄生線蟲種類的鑑定，利用該技術鑑別來自山羊、綿羊、牛和豬體內的 24 種毛圓線蟲 , 對核糖體 DNA 內轉錄間隔區（ITS）的PCR-RFLP分析結果表明 , ITS-1和ITS-2是鑑別寄生線蟲種類的特異性遺傳標記[34].以RAPD作為種類特異性的標記對毛圓線蟲進行鑑定，但是這些寄生線蟲的種內高度變異使得鑑定結果不可靠，需要同時結合生態學和形態學一起進行種類上的鑑別[35].

　　2.3 肺線蟲利用線粒體 cox1 基因分析瑞典胎生肺線蟲（Dictyocaulus viviparus）的種群遺傳結構，資料分析後共得到12個單倍體，單倍型多型性和核苷酸多型性分別是0.160和0.002, 不同地理起源的12個單倍體聚類分析沒有發現明顯的遺傳結構 , 分析結果表明牛肺線蟲的種群內部遺傳差異較小，並且種群間的基因流動也較低[36].利用AFLP標記對來自瑞典的胎生肺線蟲的8個野生株和1個實驗室株的種群遺傳結構進行分析，結果顯示種群內的雜合體較少，這可能與種群的突變率和遷移率保持平衡有關。從AFLP圖譜上可發現實驗室株與野生株的種群遺傳結構有所不同。將野生株和實驗室株作為一個整體時，分析結果顯示有50%的變異發生在種群內部。而8個野生株單獨分析時，發現有60%的變異發生在種群內部[37].應用mtDNA （cox3、 nad5、 rrnL、 trna）和AFLP兩種分子標記對同樣的8個野生株和1個實驗室株進行種群遺傳結構研究，發現這8個野生株中至少存在3個亞種群結構，其中有1個占主導地位。在這個占主導地位的種群中又分化出兩個較小的遺傳組群，該分析結果意味著這些牛肺線蟲有著多重的來源[38].

　　2.4 環揹帶線蟲（Teladorsagia circumcincta）使用線粒體nad4基因研究來自法國和摩洛哥的11個環揹帶線蟲種群的遺傳結構，結果顯示所有的種群都呈現高度的核苷酸多型性，在小規模的地理範圍內（小於200 km）種群沒有發生遺傳亞分化 , 在大規模的地理範圍內FST值比較顯著，但種群之間的遺傳差異不明顯[39].由於環揹帶線蟲的種群遺傳學資訊較少，限制了對藥物抗藥性的研究， Grillo等[40]在2006年透過環揹帶線蟲的EST資料庫篩選了7個多型性豐富、穩定性好、擴增效率高的微衛星位點用於種群遺傳學的研究。以5對微衛星標記分析環揹帶線蟲的9個野生株和3個實驗室株的種群內和種群間的遺傳關係，結果顯示所有的種群均在種群內部表現出了高度的遺傳變異。對於來自英國不同地理起源的野生株和實驗室株的種群沒有檢測到遺傳差異；而來自法國野生株的4個種群和來自紐西蘭實驗室株的1個種群在種群間表現出明顯的遺傳差異。最後分析結果表明寄生在山羊體內的環揹帶線蟲不是單一的蟲種，有可能存在隱藏種[41].

　　2.5 鉤蟲將 PCR-SSCP 標記與 DNA 測序相結合研究犬鉤蟲（Ancylostoma caninum）、十二指腸鉤蟲（ Ancylostoma duodenale）和美洲鉤蟲（ Necatoramericanus）的群體遺傳結構 , 結果表明在犬鉤蟲和十二指腸鉤蟲中存在著亞種結構，來自中國和多哥的美洲鉤蟲有4個不同的核苷酸固定位點變異，暗示美洲鉤蟲是一個複雜的種群，這些發現說明鉤蟲的種群遺傳學研究有著重要的流行病學意義[42 ].以線粒體cox1基因為遺傳標記，對寄生在人、狗和貓體內的鉤蟲的遺傳特徵進行研究，系統發育分析發現不同宿主體內的鉤蟲分成兩個聚類群，其中一簇包括寄生在人體內的3個隔離株，另一簇由寄生在人和動物體內的19個隔離株組成。進一步分析發現兩個聚類群的鉤蟲的核苷酸序列有5個鹼基的差異，這些發現意味著不同宿主體內的鉤蟲可能存在相似的單倍型[43]. 以同樣的遺傳標記對寄生在澳洲海獅（Neophoca cinerea）體內的鉤蟲進行種群遺傳結構分析，研究發現種群間基因流動高，遺傳分化程度較低，反駁了由於地理隔離阻礙了鉤蟲基因流動的假設[44].

　　2.6 鼠類圓線蟲利用PCR-RFLP標記對來自英國和德國的鼠類圓線蟲（Strongyloides ratti）（寄生在野生鼠體內）種群遺傳結構進行分析，分析表明來自宿主體內不同個體間的差異為73.3%, 同一取樣地點不同種群間的差異為25.3%, 不同取樣地點之間的樣品遺傳差異很小，為1.4%, 得到的資料說明鼠類圓線蟲的種群間存在著一定的基因流[45].

　　2.7 其它線蟲 Dame 等[46 ]在1992年應用線粒體標記分析奧斯特線蟲（Ostertagia ostertagi）的種群遺傳多樣性，發現來自不同地理位置的種群間存在很高的基因流。利用RAPD標記技術，選擇10條隨機性引物擴增異小杆線蟲（Heterorhabditis）的基因組DNA,分析噬菌異小杆線蟲（Heterorhabditis bacteriophora）（HP88 和E1），夏威夷異小杆線蟲（H. hawaiiensis）（ MG-13） , H. hepialius （ Bodega Bay） , H. indicus（EMS-13和Coimbatore），大異小杆線蟲（H. megidis）（HSH2和HO1）， H. zealandica和H. marelatus （OH10）等7種異小杆線蟲和不同隔離株之間的遺傳相似度及差異關系 . H. hawaiiensis MG-13、 H. indicus和H. zealandica這3種線蟲來自哥倫比亞 , EMS-13隔離株來自埃及 , H . hepialius 來自加利福尼亞 ,H. marelatus來自美國 . 結果表明同一種個體間平均相似百分比為96.25%, 比較異小杆線蟲的3個種時，發現隔離株之間的平均相似百分比為83.8%,不同種之間的平均相似百分比為31.3%[47].

　　應用PCR-SSCP標記和對線粒體cox1基因的部分片段測序兩種方法，有學者分析了來自歐洲和亞洲不同地理起源，寄生在貓、狗和狐狸體內的結膜吸允線蟲（Thelazia callipaeda）的種群遺傳結構。對歐洲37個個體（寄生在狗、狐狸和貓體內）的cox1基因序列進行分析，發現有6個核苷酸位點沒有發生突變。而對亞洲的13個個體（寄生在狗體內）的cox1基因序列進行分析 , 發現這6個核苷酸位點中5個位點發生了G→A轉換， 1個位點發生了C→T轉換。 PCR-SSCP標記的分析結果與線粒體cox1基因測序分析結果一致，說明PCR-SSCP對於結膜吸允線蟲的種群遺傳學研究是一個很好的分子遺傳標記[48].

　　利用PCR-SSCP標記分析寄生在有袋類和齧齒類動物體內的毛細線蟲（Capillaria sensulato）的種群遺傳結構，結果表明來自同一宿主體內的毛細線蟲沒有表現出明顯的遺傳差異，並且在同一宿主體內此類線蟲會寄生在1~3個不同的組織器官中，但是來自不同宿主體內的毛細線蟲則存在較明顯的遺傳差異，提示可能由寄生宿主種類的特異性引起毛細線蟲的種群遺傳差異[49].

　　3結語

　　隨著分子生物學技術突飛猛進的發展，對寄生線蟲的分子分類學、分子進化學和種群遺傳學等方面取得了一些研究進展，但對於寄生線蟲這個龐大的生物群體而言還存在很多的科學空白。近些年來，國內開展了關於捻轉血矛線蟲[26]、旋毛蟲[50]、美洲鉤蟲[51]和弓首蛔蟲（Toxocara）[52]等寄生線蟲種群遺傳學的研究，這些研究將為進一步瞭解寄生線蟲的種群遺傳學特徵提供良好的理論支援。分子遺傳標記技術的發展對寄生線蟲新蟲種的分子鑑定和系統進化的研究起到了巨大的推動作用。然而，對於大多數寄生線蟲而言，基因組和遺傳進化資訊尚且未知，這些資料的匱乏使得對寄生線蟲的宿主群的形成過程、宿主的防禦和選擇壓力以及寄生蟲藥物抗藥性形成的研究捉襟見肘，不斷豐富寄生線蟲在基因組、轉錄組、蛋白組以及代謝組等方面的資料，將會對研究其分子分類學、群體遺傳學、分子流行病學和寄生蟲病的防治提供重要的幫助。

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