研究結核分枝桿菌中自噬的作用論文

　　從酵母菌到人類，自噬是一種廣泛存在的生物代謝過程。早期認為，自噬是宿主細胞在飢餓條件下透過降解受損或衰老的細胞器/蛋白質來補充營養物質。除了物質再迴圈，自噬在各種生理和病理生理過程中也起著關鍵作用，如胞質成分的清除、細胞生長、衰老和死亡。此外，自噬也參與協調全身的固有免疫、適應性免疫和炎症反應。結核病( tuberculosis，TB) 是由結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB) 引起的慢性細胞內感染，研究表明自噬參與抗MTB 感染的宿主防禦應答。現就自噬在宿主抗MTB 感染免疫應答中的作用進行綜述。

　　1 自噬的細胞和分子水平

　　自噬是真核生物中高度保守的細胞降解途徑，透過消化降解自身胞質成分，實現大分子物質的回收利用。自噬可分為3 類: 大自噬、小自噬以及分子伴侶介導的自噬( chaperonemediatedautophagy，CMA) 。大自噬( 以下稱作自噬) 是將胞質蛋白或細胞器包裹形成自噬小體進行降解。自噬可響應於各種脅迫狀態，例如飢餓可上調自噬，但營養豐富的條件下自噬也具有本底活性。自噬可以是非選擇性( 例如當氨基酸不足時) 或選擇性，選擇性自噬包括細胞器特異性自噬( 線粒體自噬、過氧化物酶體自噬和內質網自噬) 和異源性自噬( 清除病原體的途徑)。一系列體外實驗[2]初步闡明瞭自噬的分子機制，超過30 多種自噬相關基因( autophagy-related genes，ATG) 蛋白產物參與自噬的訊號傳遞與調節: 類線蟲51 樣蛋白激酶/黏著斑激酶家族相互作用蛋白200 ( Unc-51-like kinase /focaladhesion kinase family interacting protein of 200 kD，ULK/FIP200) /ATG101 /ATG13 蛋白激酶複合物，Vps34 /beclin-1 /Vps15 /ATG14 脂質激酶複合物，這2 種複合物相互作用產生富含磷脂醯肌醇三磷酸( phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3) 的吞噬泡; 2 種泛素樣蛋白綴合系統( conjugationsystem) : ATG5 /ATG12 /ATG16 複合物和ATG8 /微管相關蛋白1輕鏈3( microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，膜結合的ATG8 為自噬體膜特異性表達，常被用作自噬的檢測手段。

　　2 MTB 的生存策略

　　MTB 是結核病致病病原菌，MTB 的特徵是高感染率和低根除率。MTB 透過阻斷吞噬體合成和成熟從而使MTB 在感染的巨噬細胞中長期生存。MTB 使用多種策略避免被殺滅:溶解並從吞噬體逃脫，修飾吞噬體阻礙其成熟，甚至在酸性/被降解的吞噬體中長期生存。自噬是宿主防禦MTB 的有效途徑之一，自噬可直接消滅胞內MTB，從而限制MTB 的生長。細菌感染可誘發宿主細胞內形成雙層膜室( 稱為自噬體) ，並同溶酶體融合，降解吞噬的病原體。有研究揭示某些細菌能抑制誘導自噬的訊號傳遞，干擾自噬機制來逃逸或阻止溶酶體和自噬體的融合，利用宿主蛋白掩飾自身以避免被識別，甚至有些細菌主動利用自噬元件來促進自身在細胞內生存生長。MTB 可透過啟用哺乳動物雷帕黴素靶蛋白( mammalian target ofrapamycin，mTOR) 依賴的Wnt /SHH( Hedgehog 的同源基因，Sonic Hedgehog) 訊號通路抑制γ 干擾素( interferon γ，IFN-γ)介導的自噬。

　　3 自噬抗結核感染中的作用

　　自噬作為固有免疫和適應性免疫通路的下游效應之一，在抗MTB 感染的免疫應答過程中發揮著不可或缺的作用: 傳遞Toll 樣受體( Toll-like receptors，TLR) 等固有免疫受體訊號，協同細胞因子發揮防禦作用，調節免疫相關GTP 酶( immunityrelated GTPase，IRG) 途徑，增強抗原提呈和影響T 細胞的穩__態等。多條宿主防禦MTB 的免疫通路啟用自噬，現初步明確抗MTB 自噬的亞細胞定位和誘導機制。

　　3. 1 自噬是病原體相關分子模式( pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP) 調控的效應器模式識別受體( pattern recognition receptors，PRR) 主要表達於固有免疫細胞胞膜表面或細胞質中，一種PRR 可識別一種或多種PAMP，其中Toll 樣受體是宿主識別病原微生物( 包括MTB) 啟用固有免疫防禦機制的關鍵啟動點。目前為止，共發現10 個人類TLR 和12 個小鼠TLR。參與識別MTBPAMP 的TLR 主要有: TLR2 ( 與TLR1 /TLR6 形成異源二聚體) 、TLR4 以及TLR9( 識別MTB 的DNA) 。這些TLR 同樣參與到抗MTB 的自噬訊號通路中，TLR 訊號調節固有免疫防禦的啟動和發展，透過與細胞自噬通路合作消除胞內MTB。抗菌肽是極為重要的針對MTB 的免疫防禦物質。MTB表面的脂蛋白可以刺激人類巨噬細胞TLR2 /TLR1，產生抗菌肽，增強維生素D 受體訊號轉導和提高細胞自噬活性，促進自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體殺滅細菌。TLR 訊號介導的自噬訊號轉導途徑，大致可分為髓樣分化因子88( myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88) 非依賴性和MyD88 依賴性。脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 是TLR4 的配體，刺激巨噬細胞可增強MTB 吞噬體與自噬體的共定位，LPS 誘導的自噬是MyD88 非依賴性，依賴於TLR4 /含有TIR 結構域的誘導干擾素β 的接頭蛋白/受體相互作用蛋白1 /p38 絲裂原活化蛋白激酶( TLR4 /TIR domain-containingadaptor protein / receptor interacting protein 1 /p38 mitogenactivatedprotein kinases，TLR4 /TRIF/RIP1 /p38MAPK) 訊號途徑，同自噬引起的細胞凋亡通路不同，這條通路並不影響細胞生存。刺激TLR7 可透過MyD88 依賴性途徑誘導自噬殺滅胞內MTB，beclin 1 ( 酵母ATG6 同系物) 和Atg5 參與其中。然而，TLR7 並不識別MTB 病原體相關分子模式，但仍能加強宿主細胞對胞內MTB 的.清除作用。其他不參與到MTB 的識別作用的PRR 介導自噬的研究也證實了這點。因此即使靶病原體組分不是特定TLR 的配體，但增強其介導的自噬活性仍然能加強對病原體的清除，眾多TLR 和其配體啟用的自噬在消除胞內MTB 中發揮重要作用。

　　3. 2 自噬協同細胞因子發揮炎症作用細胞因子在宿主防禦MTB 中起到重要作用: Th1 細胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor α，TNF-α) 和白細胞介素12( interleukin 12，IL-12) 在抵禦MTB 中發揮著作用，Th2 細胞因子IL-4 的水平，與疾病嚴重程度相關。一系列細胞因子和自噬相關的研究表明，Th1 細胞因子活化自噬，而Th2 細胞因子抑制自噬。IFN-γ 對宿主抗MTB 至關重要，在小鼠中，IFN-γ 介導誘導型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，NOS2) 透過生產NO 抑制MTB 的生存，同時啟用自噬來克服MTB 引起的吞噬體成熟障礙。對TNF-α 誘導的自噬抗MTB 的機制研究則更為深入，TNF-α 透過阻斷蛋白激酶B ( proteinkinase B，Akt) 導致mTOR 的失活從而促進細胞自噬水平，AGT4 和活性氧( reactive oxygen species，ROS) 參與其中。IL-4 和IL-13 是兩種典型的Th2 細胞因子，可以抑制NO 的產生，衰減巨噬細胞對胞內MTB 的殺滅能力。體外實驗中，IL-4 和IL-13 拮抗自噬以及其對MTB 的殺滅作用。IL-4和IL-13 抑制飢餓誘導的自噬是透過依賴Akt 訊號通路，然而Akt 訊號並不參與IFN-γ 誘導的自噬。抗自噬效應蛋白Bcl-2和Bcl-XL 參與IL-4 和IL-13 介導的抑制自噬作用，機制是Bcl-2 和Bcl-XL 可以同beclin 1 直接結合，從而阻斷自噬的程序。總的來說Akt 訊號參與到抑制飢餓誘導的自噬，而STAT6 訊號途徑參與到抑制通路IFN-γ 誘導的自噬。IL-10和IL-6 也被發現能夠抑制自噬，在MTB 感染的THP-1 細胞中，IL-6 透過降低ATG12 /ATG5 複合物的表達，阻礙自噬體的合成而發揮抑制效應。MTB 可以上調IL-6 的生產，抑制自噬，以維持自身的生存，mTOR、p38MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminal kinase，JNK) 訊號通路參與其中。IL-10 抑制雷帕黴素誘導的自噬作用依賴Akt 和訊號轉導子和轉錄啟用子3/6( signal transducer and activator of transcription 3/6，STAT3/6) 途徑，而拮抗飢餓誘導的自噬是依賴於1 型磷脂醯肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /Akt 訊號，小鼠巨噬細胞中，也觀察到IL-10 抑制LPS 誘導的自噬作用。阻斷自噬將抑制TNF-α 的分泌，增強促炎分子( 如IL-1β 等)的產生，啟用自噬能夠促進TNF-α 誘導的核因子κB( nuclear factor-Kappa B，NF-κB) 活化和細胞間黏附分子1( intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1) 的表達，這表明細胞因子同自噬條件作用或許是相互的。

　　3. 3 IRG 參與自噬的抗菌作用在對IFN-γ 誘導自噬抗MTB 的精確機制研究中，發現IRG 參與其中。在小鼠研究中證實IFN-γ 的刺激使包含MTB的吞噬體能夠募集免疫相關GTP 酶M1 ( immune-relatedGTPase M1，IRGM1)，Irgm1 是小鼠IRG 家族的一個成員。Irgm1 對吞噬體的作用機制仍然是模糊的，甚至Irgm1 對自噬的影響可能是雙面的，一方面同IFN-γ 協同作用，以促進抗菌響應，另一方面Irgm1也負調節IFN-γ 介導的自噬，限制免疫細胞的自噬效應。人類基因組中有3 種IRG 旁系同源物，即IRGC、IRGQ和IRGM，但是隻有IRGM 是有功能的。該IRGM 基因位於染色體5q33. 1，且有5 個外顯子。第一外顯子較長編碼181 個氨基酸; 4 個較短的外顯子從所述第一外顯子向下遊延伸超過50 000 bp 。多項分子流行病學研究表明IRGM基因的啟動子區域的變化，顯示出與MTB 感染的風險增加有關。結核病易感性同IRGM 多型性有關，並與多種參與調節自噬過程的其他基因關聯。然而，包括宿主的種族、MTB 的種屬和地理環境等多種因素均可影響MTB 敏感性。因此需要更多的研究( 包括體內模型) ，才能正確評估自噬相關基因多型性與結核病易感性之間的關係。

　　3. 4 自噬在抗原提程和T 細胞穩態中的作用T 細胞透過監測由抗原提呈細胞提呈的抗原肽來調節適應性免疫應答作用。主要組織相容複合體( major histocompatibilitycomplex，MHC) Ⅱ類分子提呈的抗原由CD4 + T 細胞識別。自噬能間接或直接增強MHCⅡ類分子對抗原的呈遞作用，在巨噬細胞和樹突狀細胞中TLR7 和TLR9 等有效的上調由卡介苗抑制的MHCⅡ表達，自噬可以協同TLR 免疫效應增強抗原特異性CD4 + T 細胞的活化。此外，在感染了MTB 的小鼠巨噬細胞和CD11 + 樹突狀細胞表面，用雷帕黴素上調的自噬能夠直接增加MTB 分泌抗原Ag85B 抗原遞呈。自噬除了透過影響抗原呈遞調控T 細胞應答外，能直接作用T 細胞，包括調節T 細胞內環境穩定、活化和死亡。在胸腺T 細胞中，從雙陰性到單陽性細胞發展的各個階段，均檢測到自噬活性。自噬對胸腺祖細胞的生存是必要的，Atg5缺陷的人重組啟用基因2( recombinant human activated gene 2，RAG2) 和beclin1 基因缺陷的RAG1 - / - 嵌合體存在大大降低了胸腺細胞的總數。外周T 細胞中也顯示出自噬的本底水平，T 細胞受體( T cell receptor，TCR) 配體的啟用可以上調這種水平。在啟用的Jurkat T 細胞中，NF-κB 介導的beclin1基因表達上調，支援了TCR 配體啟用的自噬可以增加beclin1的表達。磷脂醯肌醇3 激酶催化亞基3 型( phosphatidylinositol3-kinase，catalytic subunit type 3，Vps34 ) /beclin1 複合物在T 細胞調控自噬的作用是矛盾的結果。在一項研究中，Vps34 缺陷的T 細胞保有自噬活性，但表現出IL-7 受體的缺失，從而降低細胞的存活。然而在不同的基因敲除模型，顯示Vps34 對啟用T 細胞中的自噬是必須的。因此T 細胞中自噬的活化可能存在2 種途徑即Vps34 /beclin1 依賴的經典途徑和非依賴Vps34 /beclin1 途徑。

　　4 自噬相關的抗MTB 治療及展望

　　自噬與MTB 感染有著複雜的相互作用，深入的體內外研究為將抗MTB 藥物帶來新的見解。自噬的治療意義為臨床研究提供新的策略: 完善抗結核化療傳統方案，老藥新用，將免疫治療與自噬相結合等。例如，常用的抗結核藥物異煙肼和吡嗪醯胺能夠促進自噬的啟用。雷帕黴素( mTOR 抑制劑) 能夠引起mTOR 訊號介導的自噬，在巨噬細胞的研究中表明，高劑量雷帕黴素能夠有效殺滅分枝桿菌，然而低劑量的mTOR 抑制劑效果不明顯。他汀類藥物是常用的降膽固醇藥物，它們也可以影響免疫應答。他汀類藥物治療透過促進自噬和吞噬體成熟從而殺滅人類和小鼠巨噬細胞中的結核桿菌。雷帕黴素、他汀類藥物或維生素D等藥物可能會透過誘導自噬提高MTB 的治療但長期或過量的自噬能增加細胞死亡，透過啟用自噬來改善結核病治療的最佳方式需要進一步研究。DNA 疫苗是很有前途的新一代疫苗，可以透過DNA 編碼目的抗原引發特異性免疫應答。抗MTB Ag85B DNA 疫苗的研究中，與細胞自噬相結合的DNA疫苗療法能顯著增強Th1 型細胞因子( IFN-γ 和IL-2) 表達和CD4 + T 細胞免疫效應，利用自噬途徑或許代表了抗MTB疫苗接種一個新興的方向。研究MTB 免疫機制和ATG 蛋白質之間的相互作用一直是近年來研究的主要焦點，大量的研究將使人們更好地理解細菌逃逸自噬的機制，並將其用於治療MTB 感染的未來藥物設計中。