斑馬魚早期胚胎背腹發育中ripply1的作用論文

　　胚軸（ embryonic axes）形成是多細胞生物軀體模式（ body plan）建立的一個重要過程，主要包括前- 後軸（ anterior-posterior axis ）、背 - 腹軸（ dorsal-ventral axis）和左 - 右軸（ left-right axis） .對兩棲動物胚胎的研究發現背 - 腹軸早在受精後即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉動形成的灰色新月區在後期發育成背部。德國發育生物學家 Hans Spemann 和他的學生 Hilde Mangold 將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自於供體胚胎，而神經管和體節多數來自於受體，這說明該背部組織能誘導周圍受體胚胎的細胞形成神經管，首次提出了胚胎誘導的概念並稱該背部組織為組織者（ or-ganizer） .

　　ripply 家族蛋白在 2005 年被發現並揭示了其部分功能[1],研究發現 ripply1 和 ripply2 特異表達於體節，其中 Ripply1 蛋白與轉錄輔抑制因子 Groucho 結合，能夠終止分節基因的表達，維持體節的前後極性。之後對 ripply1 的研究都集中在其在體節時期對體節發生的作用，而其在早期胚胎模式發生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發現 ripply家族蛋白能透過其 WRPW 區域結合多梳蛋白（ Polycomb group proteins）起轉錄去抑制的作用，並且在背 - 腹軸形成過程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎髮育早期的.表達圖式和調節方式還不清楚。並且，ripply3 是人的唐氏綜合徵關鍵區域基因 6（ Down syndrome critical region gene 6,dscr6）的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用機制能為人類遺傳疾病的致病機理提供資訊。我們透過原位雜交技術發現 ripply1 在斑馬魚早期胚胎中特異表達在背部，因此推測其可能參與背腹發生。故而透過過表達 ripply1,並調取1. 2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發生的作用。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　AB 品系的斑馬魚養殖在 28. 5℃ 的迴圈水系統中，如早期工作所描述[4].

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 獲取 ripply1 cDNA取斑馬魚胚盾（ shield）時期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎總 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒反轉錄，詳細步驟參見使用說明書。

　　1. 2. 2 斑馬魚 ripply1 整胚原位雜交調取 ripply1 全長 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶擴增後將其連入 pGEM-T 載體中。根據測序方向合成地高辛標記的反義 RNA 作為探針使用。其他探針如goosecoid （ gsc）、chordin （ chd）、floating head （ flh）、even-skipped-like 1 （ eve1）、T-box6 （ tbx6）、wnt8a 詳見作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反義 RNA 用原位雜交液 hyb+（ 50%甲醯胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20,0. 5 mg/mL酵母 RNA,0. 05 mg/mL 肝素）稀釋至 1 ng/μL.收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定於 4% 多聚甲醛中過夜。過渡到含 0. 1% Tween-20 的 PBST 中，並在PBST 中將胚胎膜剝去，用 PBST 洗過後在原位雜交液 hyb-（ 50% 甲醯胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20）中65℃ 孵育 10 min,之後在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探針 60℃ 孵育過夜。第 2 天吸出探針以重複使用。

　　胚胎用洗液 I（ 50% 甲醯胺，2 × SSC,0. 1% Tween-20）洗 30 min（ 60℃ ） ,重複 1 次；用洗液 II （ 5% 甲醯胺，0. 2 × SSC,0. 1%Tween-20）洗15 min（ 60℃） ,重複 1 次；用洗液 III （ 0. 5% 甲醯胺，0. 02 × SSC,0. 1% Tween-20）洗 30 min（ 60℃ ） ,重複 1 次。然後用 MABT 在室溫下洗3 次，用封閉液封閉4 h.偶聯鹼性磷酸酶的地高辛抗體 1∶ 2500 稀釋於封閉液中，4℃ 孵育過夜。第 3 天吸出抗體以重複使用，用MABT 在室溫下洗 30 min,重複 1 次；用 PBST 在室溫下洗 30 min,重複 1 次；在平衡緩衝液（ 0. 1 mol/LNaCl,0. 1 mol / L Tris-HCl pH 9. 5,0. 05 mol / L MgCl2,0. 1% Tween-20）中平衡 10 min,加顯色液（ 5 mL 平衡緩衝液中加100 μL 60 mg/mL 左旋咪唑，100 μLNBT / BCIP） ,室溫避光，待訊號足夠強加多聚甲醛終止反應，在70%酒精中脫去浮色，拍照觀察。

　　1. 2. 3 顯微注射 ripply1 mRNA顯微注射方法詳見早期工作[5].ripply1 mRNA注射劑量為每個胚胎 200 pg.

　　1. 2. 4 ripply1 啟動子序列及轉基因魚的獲得從基因組中調取 ripply1 基因組上游約 1. 2 kb的片段，引物如下： promoter-F: 5'-ATTCTCGAGG-GATCCAAAACAGCTTAT-3',promoter-R: 5 '-ATTA-GATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3'.並且在上下游引物中分別引入 Xho I 和 Bgl II 酶切位點，雙酶後切連入 pT2A200R150G 載體。

　　單獨注射該質粒觀察胚胎是否有熒光。有熒光後將該質粒和轉座酶 mRNA 共注射，劑量均為 50pg,待該批註射的斑馬魚 F0 代性成熟後外交，篩選後代胚胎有特異熒光的 F1 代。

　　2 結果

　　2. 1 整胚原位雜交揭示 ripply1 在斑馬魚早期胚胎髮育過程中的表達模式為了明確 ripply1 是否參與早期背 - 腹軸的形成，我們首先利用整胚原位雜交檢測該基因的時空表達圖式。結果顯示 ripply1 母源表達，但表達水平低。在原腸作用早期即胚環期表達增強且集中在預定背部的胚盾位置，在胚盾期 ripply1 在背部的表達繼續增強，並且向側部延伸。在原腸期，隨著細胞運動的進行，ripply1 主要表達在前脊索板中胚層和後部將要形成的體節中，但在脊索中胚層中沒有表達（圖 1） .這個表達圖式暗示 ripply1 基因可能在背- 腹軸和前 - 後軸形成過程中起調節作用。

　　2. 2 高表達 ripply1 導致胚胎背部化

　　我們下一步對 ripply1 在背 - 腹軸形成中的作用進行了功能檢測。在胚胎 1 細胞期透過注射 rip-ply1 mRNA 進行高表達，收集胚盾時期的胚胎進行原位雜交。分別檢測背部標記基因 gsc、chd、flh 和腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 的表達。我們發現幾乎所有 ripply1 注射的胚胎背部標記基因 gsc、chd、flh 表達不但在背部增強並且明顯向腹側擴增。

　　相反，腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 表達明顯減弱（圖 2） .這個結果說明高表達 Ripply1 改變了背腹細胞的命運，使背部區域擴大。顯示 ripply1 能調節斑馬魚背部的發育。在 10 hpf（胚芽期）時觀察胚胎的表型，發現原本呈球形的胚胎前後伸長，呈現明顯的橢球形，這是典型的背部化表型（圖 3A,B） .24 hpf 後觀察胚胎，大多數胚胎（ 82/99）表現出背部化，其中 36 枚胚胎頭部增大，尾部缺失（圖 3C,D） ,而 46 枚胚胎頭部明顯增大，體軸變短，尾部變短，無腹部尾鰭（圖 3E） ,一小部分胚胎（ 6/99）甚至呈現雙體軸（結果未顯示） .這些表型進一步說明 ripply1 透過抑制胚胎後部發育來促進前部的發育。

　　2. 3 ripply1 啟動子及轉基因斑馬魚

　　為了研究 ripply1 時空表達的調節機制，我們開展了對其啟動子的研究。獲得 ripply1 轉錄起始位點上游 1. 2kb 的片段後，將其後加 EGFP,然後克隆到 pT2A200R150G 轉基因載體上（圖4A,B） .質粒注射後發現在胚盾期在胚盾處有特異的熒光表達（圖 4C,D） ,體節期在體節處有特異的表達（結果未顯示） ,說明該 1. 2 kb 的片段能夠調控 ripply1 在斑馬魚胚胎中時空特異的表達。與轉座酶共注獲得轉基因魚 ripply1: EGFP 的 F0 代，發現其子代在 1細胞期即有熒光，直到胚盾期仍是泛表達（圖 5A-C‘） ,可能是由於 EGFP 比較穩定，而母源的 ripply1比較容易降解。在體節期該熒光則特異定位在軀幹（圖 5D,D’） .在 24 hpf,EGFP 訊號主要集中在體節中（圖 5E） ,而在成魚中，EGFP 訊號主要集中在整個軀幹部分（圖 5F-G‘） .