細胞與克隆技術論文

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　　家兔克隆骨髓基質細胞的體外培養

　　【摘要】 目的：探討家兔骨髓基質細胞在體外傳代的培養。方法取家兔股骨骨髓，分離骨髓基質細胞，於1640培養體系中培養，之後固定計數。結果在2~6×106 個/cm2範圍內，其接種細胞數與所形成的克隆集落(CFU-F)數呈良好線性關係。隨著培養時間的延長，克隆集落也增多，變大。3周齡家兔的造血基質祖細胞較6周齡者為多。結論基質祖細胞CFU-F呈非均質性的，可能存在不同亞群。

　　【關鍵詞】 家兔;骨髓;造血基質祖細胞;克隆

　　骨髓基質細胞是支援和調節造血細胞定居、增殖、分化、發育和成熟的內環境主要細胞成分[1]。曾對小鼠體外單層培養造血基質細胞的培養研究，發現其接種的細胞數與成集落數呈良好的線性關係[2]。目前對家兔的骨髓器官基質細胞的研究國內研究有過報道[3]。本文用體外培養骨髓基質細胞技術[4]對家兔的骨髓基質細胞體外培養特點進行了探討。

　　1 資料與方法

　　1.1 材料來源實驗動物系北京科宇動物養殖中心飼養的雌雄兩性、3~6周齡之純種家兔。

　　1.2 主要試劑與器材 RPME1640培養液，小牛血清(中國藥品生物製品檢定所)，平底中性玻璃培養瓶，二氧化碳孵箱，微孔濾網。

　　1.3 骨髓單個核細胞製備 6周齡家兔用乙醚麻醉處死;3周齡者則用頸椎脫臼致死。在無菌條件下取雙側股骨修潔後剪掉骺端，用帶16號針頭注射器以1640培養液衝出骨髓細胞，再用濾網過濾製取單個核細胞懸液，計數後用所需細胞量進行體外CFU-F培養。

　　1.4 CFU-F培養和測定將6周齡家兔的骨髓細胞以2×106 個/cm2, 3周齡的以2~6×106 個/cm2置於含20%小牛血清的1640培養液的培養體系的培養瓶中，於37℃，5%CO2，飽和溼度的CO2培養箱內培養。分別於第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培養液換液，培養到第八天沖洗後用甲醛固定半小時，蒸餾水沖洗後用姬姆薩染色12 min後晾乾，待計數用。

　　2 結果

　　2.1 CFU-F克隆集落形成過程觀察於培養第4天在倒置顯微鏡下觀察培養細胞，發現淡紅色背景下(紅細胞)有圓形發亮的.較大基質細胞生長，拉長的細胞較少見，振盪後觀察未見發亮細胞浮起，說明細胞已貼壁。培養第六天鏡下觀察，發現基質細胞明顯增多，拉長者較多，形成了克隆集落，6周齡的骨髓基質細胞生長速度明顯低於3周齡者，且培養同天數的6周齡的克隆集落數明顯低於3周齡的克隆集落數。

　　2.2 CFU-F計數計數由50個以上細胞所形成的集落數，結果如圖1、2和表1。由50~99個細胞組成的集落為小集落，由100~199個細胞組成的集落為中集落，>200個細胞者的為大集落。

　　3 討論

　　從以上述結果可以發現：培養時間越長，形成克隆集落相對越多，3周齡者，骨髓細胞較多，造血基質祖細胞也較多，形成的克隆集落數也多。在2~6×106個/cm2範圍內，形成的克隆集落數與種植細胞數呈良好的線性關係。

　　透過對集落大小，所含細胞數與密度比較，表明CFU-F非均質性的，可能存在不同亞群。這對體外培養骨髓細胞的增殖與分化有一定的指導意義。

　　參考文獻

　　[1] 姚程，彭麗萍，姜振宇,等.骨髓基質細胞體外擴增能力及支援造血的研究.白求恩醫科大學學報,2001,17(4)：386-388.

　　[2] 於洪臣, 郭佔之, 畢曉穎, 等.白求恩醫科大學學報, 1991,17(3):219.

　　[3] 王春豔，何欣，李增新,等.兔骨髓基質細胞的分離培養研究.北華大學學報，2005,6(6)：520-522.

　　[4] 蔡國鋒，黃開，章慶國.兔骨髓基質幹細胞體外培養的實驗研究.東南大學學報，2006，25(1)：16-19.