真核細胞rna提取的實驗報告範文

真核細胞rna提取的實驗報告範文

　　篇一：真核細胞RNA的提取

　　一．原理

　　本方法利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細胞，採用有機溶劑抽提去除蛋白質。透過選擇性沉澱RNA分子去除DNA。

　　二．方法

　　1.樣品處理

　　⑴組織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重後，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進行RNA提取，或液氮中速凍-70℃儲存。

　　⑵貼壁培養細胞處理：用PBS洗細胞一次，吸乾溶液後將培養板快速移至液氮中冷凍後轉到-70℃儲存；或加入1ml勻漿至培養板中直接裂解細胞，然後將粘稠的裂解液進一步勻漿。

　　⑶懸浮培養細胞處理：離心收集細胞，用PHS懸浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，則可經液氮速凍後轉至一70℃貯存備用。

　　2．加l()倍體積鹽酸胍勻漿液[至準備好的樣品細胞中，高速勻漿1min。

　　3．勻漿液5000g，室溫離心10min。

　　4．將上清移至一個乾淨離心管中，加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉（PH5.2），混勻，再加5體積預冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃放置至少2小時。

　　5．5000g 0℃離心10分鐘沉澱核酸，棄上清液，室溫乾燥。

　　6，每個提取RNA的組織或細胞樣品中，加入l0～15min鹽酸胍勻漿液Ⅱ，攪拌溶解。

　　7．加入2.5體積預冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃至少放置2小時。

　　8．5000g 0℃離心10分鐘沉澱核酸，去上清，室溫揮發乙醇。

　　9．按每克組織細胞加5min的比例．分兩次加入0.02mol／L  EDTA(pH8.0) 先加1／2體積EDTA振盪l～2分鐘，3000g離心2min．吸出上清．再加另一個1/2體積的EDTA振盪l一2分鐘．合併兩次核酸溶解液。．

　　10．用等體積氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個乾淨離心管中。

　　11．加3倍體積lmol／L乙酸鈉 (PH7.0) 混勻，-20℃放置1h以上，此時RNA將選擇地沉澱，而DNA仍為溶解狀況。

　　12．5000g，0℃離心20min，沉於管底的是RNA。

　　13．吸去上清，用4℃預冷的lmol／L乙酸鈉(pH7．0)漂洗RNA沉澱。然後20℃ 5000g，離心20分鐘。回收RNA。

　　14．儘量去除上清液。按每g組織細胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉澱析出．滴加0.11mol／L NaOH調溶液pH至7．5。

　　15．加入2倍體積冰預冷乙醇混勻，0℃放置至少2小時，5000g，4℃離心10分鐘，RNA沉澱用70％乙醇漂洗，短暫離心後，棄上清，室溫乾燥蒸發乙醇。

　　16．用適當小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉澱，加入3倍體積乙醇，

　　-70℃儲存RNA備用。用時．加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉，混勻，12000g，4℃離心回收RNA。

　　三.試劑

　　1．鹽酸胍勻漿液Ⅰ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量為95.6)，O．1mol／L乙酸鈉(pH5．2)，5mmol／L 2—巰基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸鈉

　　配製方法：取191g鹽酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸鈉(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混勻後加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸鈉,振盪混勻溶解。

　　2．鹽酸胍勻漿液Ⅱ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸鈉(pH5．2),1mmol／L 2

　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

　　配製方法：取191g鹽酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸鈉(pH5．2)和1．25ml 0．2mol

　　／L 2—巰基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混勻。

　　3.乙醇

　　4.70％乙醇

　　5.氯仿—正丁醇(4：l，體積比)

　　6.4mol／L乙醇鈉，pH7.0

　　7.3mol／L乙醇鈉，pH5.2

　　8.RNA溶解液

　　成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

　　四、說明

　　提取RNA時，要特別注意防止RNase的汙染，所用玻璃器皿均應用0.1％的二乙基焦碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理。塑膠器材均使用一次性用品，並高壓滅菌處理，必要時，也可用0.1%DEPC處理。

　　篇二：真核細胞RNA的提取

　　RNA是基因表達產物，由以下幾類分子組成，rRNA（佔細胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內小分子RNA（佔10～15%）、mRNA（佔1～5%）。其中mRNA是分子生物學的主要研究物件，分離製備mRNA是克隆基因，分析基因表達以及建立cDNA文庫的首要步驟。

　　真核細胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關鍵是儘量減少RNA酶的汙染。RNA酶活性非常穩定，分佈廣泛，除細胞內源性的RNA酶外，環境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時，應儘量創造一個無RNA酶的.環境，包括去除外源性RNA酶的汙染和抑制內源性RNA酶活性。主要是採用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強力的蛋白質變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶，採用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

　　一、RNA提取 的關鍵

　　真核細胞RNA的提取過程有四個關鍵點，即①樣品（細胞或組織）的有效破碎；②有效地使核蛋白複合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用於核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。

　　二、組織RNA提取的基本步驟

　　1.儀器：勻漿器、低溫離心機、離心管。

　　2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧

　　化氫、甲醯胺、RNA上樣緩衝液。

　　3.主要步驟

　　（1）取組織50~100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。

　　氯仿，充分震盪混勻，靜置

　　0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－

　　1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉

　　澱，

　　10min。

　　l DEPC溶液，充分溶解RNA

　　RNA溶解液，按一定比例稀釋後，紫外分光光度計測

　　值，計算OD260/OD280

　　OD260＝1時，RNA濃度約為

　　）＝OD260×稀釋倍數×40

　　1%甲醛變性膠電泳觀察

　　甲醛變性凝膠板：4.5μl RNA，12000g×℃靜置2h，4℃1.7~2.0，根據下述公式計算×甲醛膠電泳緩衝液，離心。棄沉澱。 ×10min×5min離心。 ：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5μl 37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，12000g離心。 （4）棄上清，取沉澱，加入，7500g（5）棄上清，沉澱真空乾燥（6）加40μ。 4.結果鑑定 （1）紫外分光光度計檢測：取定260nm、280nmOD比值，如果比值在RNA純度可。 標準樣品當40μg/mlRNA濃度（μg/ml。 （2）電泳檢測：RNA質量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul 5

　　醛，10ul甲醯胺，離心混勻，65℃變性15min後，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上樣緩衝液，離心混勻後上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃儲存備用。

　　三、注意事項

　　1、所有玻璃器皿160～180℃高溫幹烤6h以上，非耐高溫器皿經0.1% DEPC液浸泡後，經高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配製，然後高壓處理。

　　2、實驗用水要經DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。

　　3、實驗操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶汙染。

　　藥大0942605

　　篇三：真核細胞rna提取

　　實驗原理：

　　根據成熟雌蟾蜍體內含大量卵細胞且可以方便獲取，細胞內含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優點以確定蟾蜍卵細胞為實驗所需的真核細胞。透過TRIZOL溶液中變性劑破碎真核細胞，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再利用RNA不溶於異丙醇的性質將自身析出，達到分離提純的目的。

　　TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬於解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

　　甲基綠—吡羅紅為鹼性染料，它分別能與細胞內的DNA、RNA結合呈現不同顏色。當甲基綠與吡羅紅作為混合染料時，甲基綠與染色質中DNA選擇性結合顯示綠色或藍色；吡羅紅與核仁、細胞質中的RNA選擇性結合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結合呈現綠色。而吡羅紅則與聚合程度較低的RNA結合呈現紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結合呈現紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。09419

　　實驗材料：

　　（一）試劑

　　1.甲基綠—吡羅紅染料：①染色劑A液的兩種配製方法

　　第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，加入到100mL蒸餾水中溶解，然後用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。

　　第二種方法：取甲基綠2g溶於98mL蒸餾水中，取吡羅紅G5g溶於95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（注意：用於核酸染色的是吡羅紅G，請不要錯買吡羅紅B。）

　　②染色劑B液的配製方法B液是一種緩衝液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙酸12mL，用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30mL和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL，配成pH為4.8的B液（緩衝液）。

　　③染色劑的配製染色劑是由A液、B液混合配製而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是實驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應該注意的是該試劑應現配現用。

　　2.TRIZOL試劑（Invitrogen公司購買）

　　3.75%乙醇

　　4.氯仿

　　5.異丙醇

　　6.Nacl(0.14m/l)

　　（二）器材

　　1.離心機（3000r.p.m）

　　2.冰浴

　　3．研缽

　　4.燒杯

　　5.量筒

　　6.試管

　　7.玻棒

　　8.膠頭滴管9

　　9.離心管

　　10.天平

　　實驗方法：

　　製備勻漿：

　　以班級為單位，稱取大概10g蟾蜍卵細胞（2~3℃儲存），於研缽（可置於冰浴鍋上）中，根據10~30mg組織細胞加1mltrizol試劑的量加入其中，快速研磨，製備勻漿。實驗二人合作為一組，每組取大概10ml勻漿。

　　RNA的提取：

　　取回勻漿後，室溫靜置10min，使樣品充分裂解——離心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的離心管——加1/5TRIZOL溶液體積氯仿——在手中反覆振盪搖勻，室溫靜置10min。——離心20mins——取上清液——在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min。——充分混勻，靜置10minute——離心20min——沉澱用75%乙醇洗滌兩次

　　定性試驗：

　　取2支幹淨試管，一管加入1.5MLRNA溶液（將RNA顆粒狀的沉澱溶於

　　2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸餾水1.5ML,像兩管中加入3M甲基綠-吡羅紅染色劑，溶液變成紅色為陽性反應。

　　實驗結果：

　　利用TRIZOL法可成功提取的RNA，並使得甲基綠-吡羅紅染色劑顯紅色。

　　實驗注意事項：

　　TRIzol對人體有害，使用時應戴一次性手套，注意防止濺出。

　　由於本科生實驗室裡的為普通離心機，轉速不高，故可適當延長離心時間。

　　離心後，注意上清液和沉澱的取捨以及對RNA層的小心吸取，否則將導致RNA樣品中有DNA汙染。