研究逍遙散乙醇的提取物抗抑鬱譜效關係論文
研究逍遙散乙醇的提取物抗抑鬱譜效關係論文
中藥的“譜- 效”關聯是指構建中藥的“譜”和適合的藥效評價模型，採用資料處理技術將圖譜資料和藥理學資料進行關聯，建立譜- 效關係。測定1H-NMR 譜圖需要較少樣品，掃描時間短，容易獲得，因此被廣泛應用。1H-NMR 圖譜可以客觀、全面地反映中藥化學成分的特徵。陳璟等在當前中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路的基礎上提出了基於“工藝- 指紋圖譜- 效應”研究模式。目前常用的譜- 效關係分析方法主要有灰度關聯分析、相關分析、迴歸分析和聚類分析。逍遙散出自宋代《太平惠民合劑局方》，由柴胡、當歸、白芍、白朮、(炙)甘草、茯苓、乾薑和薄荷8 味藥材組成，現代臨床以及藥理研究表明逍遙散有明顯的抗抑鬱作用。本課題組前期研究發現逍遙散低極性組分抗抑鬱作用明顯[7，8]，採用灰度關聯分析和相關分析對XYE-E 的譜效關係進行研究，表徵其藥效物質基礎，為逍遙散的新藥效開發提供依據。
1 材料和試劑
1.1 植物材料
逍遙散藥材組成為：柴胡30 g，當歸30 g，白朮30 g，白芍30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生薑10 g，薄荷10 g;以上藥材均購自山西省華陽藥業有限公司，經山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅教授鑑定為正品。
1.2 儀器和試劑
RE-52A 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR 譜儀(德國Bruker公司);Centrifuge TDL-5 型離心機(上海安亭科學儀器廠);BSA124S 分析天平(SI 德國賽多利斯公司);溫度計;計時器;有機玻璃缸等。鹽酸文拉法辛膠囊(25 mg/ 粒，批號120401，成都康弘藥業集團股份有限公司);氘代甲醇(99.8%，德國默克公司)。
1.3 動物
雄性ICR 小鼠，SPF 級，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012，18~22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物自然晝夜節律光照，適應1 周後進行實驗。
2 方法
2.1 XYE-E 的製備
XYE-E 按照以下工藝進行製備: 處方量的逍遙散藥材，加入8 倍量75% 乙醇迴流提取1.5 h，濾過，濾液濃縮至一定量後，加等倍量的乙酸乙酯萃取，振搖0.5 h，靜置0.5 h，共萃取3 次，合併萃取液，濃縮，蒸乾得XYE-E。
2. 2 XYE-E 的1H-NMR 圖譜測定
稱取XYE-E 約25 mg，加700 μL 氘代甲醇溶解，溶解液轉移至1.5 mL 離心管中，13 000 rpm 轉低溫離心10 min，移取600 μL 上清液於核磁管中，平行製備6 份，進行1H-NMR 測定。XYE-E 在25℃下於600 MHz NMR 儀上測定(頻率600.13 MHz)，採用ZG30 序列，掃描次數為64，脈衝間隔為1.0 s，延遲時間為5.0 s。氘代甲醇(δ 3.30 ppm)用於鎖場和定標。
2.3 小鼠懸尾實驗
雄性ICR 小鼠適應1 周後，隨機分為3 組，每組12只，分別為空白組，陽性組(鹽酸文拉法辛0.05 g·kg-1)，XYE-E 組(生藥46 g·kg-1)。XYE-E 使用前用0.5%CMC-Na 與0.5% 吐溫80 混合物稀釋至相應濃度，鹽酸文拉法辛使用生理鹽水稀釋至同等濃度，各組灌胃給藥20 mL·kg-1，空白組給予等量色拉油，連續14 d。末次給藥1 h 後，將小鼠尾尖1 cm 處黏貼於懸掛鉤上，並且手託小鼠將其掛入動物行為影片分析系統觀察箱中，記錄6 min 內小鼠的絕望行為，分析後4 min 內小鼠的不動時間。
2.4 小鼠強迫游泳實驗動物分組及給藥同“2.3”項下。末次給藥1 h 後，用動物行為影片分析系統記錄6 min 內小鼠的游泳行為狀況，分析後4 min 內小鼠的不動時間。
2.5 資料分析
核磁圖譜採用MestReNova 進行處理。譜- 效的資料處理採用相關分析(SPSS 16.0)和灰度關聯分析。
3 結果與分析
3.1 藥效學評價
XYE-E 對小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中不動時間的影響如圖1 所示，XYE-E 能減少小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中的不動時間，與空白對照組比較均具有顯著性差異(P < 0.01)，表明XYE-E具有明顯的抗抑鬱作用。
3.2 XYE-E 特徵峰的選擇與定量
XYE-E 的1H-NMR 圖譜，共指認出14 種化學物質，分別為柴胡皂苷類，阿魏酸，藁本內酯，白朮內酯，芍藥苷，甘草苷等物質，結果見表1。在1H-NMR 圖譜中，共振峰面積或峰高與產生該共振峰的質子數成正比，這是定量的依據，在沒有對照品時，可利用特徵峰相對含量法對物質的含量進行宏觀分析。用於定量分析的特徵峰應不受其他訊號干擾，並且達到特徵峰兩側的基線平坦。對提取物核磁圖譜採用0.01 分段積分、歸一化處理後，分別求算14 種化學物質特徵峰的相對峰面積，用相對峰面積表示物質的相對含量。
3.3 灰度關聯分析
為了進一步研究逍遙散提取物中14 種活性成分對抗抑鬱作用的貢獻大小，進行了灰度關聯分析。令Y=(y1,y2,......,yn) 為藥效資料向量，Si=(Si,1,Si,2,......Si,n) 為相對峰面積資料向量，其中i=1,2,......,m)。(1)原始資料變換：將各原始資料除以該列資料的均值，進行規格化處理。(2)計算灰色關聯絡數：其中;△ij=|yi-sij |(3)計算灰色關聯度：(4)排列順序：XYE-E 的1H-NMR 圖譜與FST 和TST 不動時間的灰度關聯分析，依據關聯度的大小，確定了各成分對抗抑鬱作用貢獻的大小順序，其中白朮內酯Ⅰ，白朮內酯Ⅱ，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷E，柴胡皂苷F，柴胡皂苷G，柴胡皂苷b2與藥效相關度較高(相關度大於0.700)。
3.4 相關分析
將1H-NMR 圖譜中指認化學物質的相對峰面積與其FST 和TST 不動時間的資料進行相關性分析，利用SPSS 16 統計軟體進行雙變數相關分析法(Bivariate)，分析結果見表3。從表3 可以看出，柴胡皂苷d 和柴胡皂苷E 與FST 不動時間的相關性較高(P<0.05，P<0.01);柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷G 與TST 不動時間的相關性較高(P<0.05，P<0.01)。與灰度關聯分析的結果一致，說明柴胡皂苷是逍遙散中發揮抗抑鬱作用的主要成分，同時也證實了柴胡在逍遙散中的君藥地位。
3.5 強迫引入迴歸分析
採用SPSS 中多元線性迴歸分析中的強迫引入法(enter)對相關性大的化學成分(P<0.05)進行多元迴歸分析，以有效成分峰面積作為自變數，FST和TST 不動時間為因變數，建立方程。在14 個色譜峰中X4(柴胡皂苷d)、X6(柴胡皂苷E)、X8(柴胡皂苷G)3 個與藥理資料密切相關的色譜峰被引人迴歸方程。所得方程為：YFST= -90.88-210.88X4+1 496.32X6(F=18.437，P=0.021，R2=0.925)Y T S T= - 1 2 7 3 . 2 5 + 7 9 3 2 . 7 9 X 8 ( F = 1 0 . 6 7 7 ，P=0.031，R2=0.727)FST 和TST 模型擬合後的決定係數R2 分別為0.925 和0.727，即變數的變差可以解釋全部抗抑鬱藥理活性變化的93% 和73%。模型的方差分析均顯示P<0.05，說明此迴歸模型有統計學意義。FST 和TST 殘差的分佈結果符合正態分佈假設，預測值的累積機率與觀測值的累積機率的散點基本散佈在直線上，說明自變數與因變數之間符合線性關係，並且標準化殘差在0 的附近波動，滿足殘差的方差齊性條件。強迫引入法分析結果顯示柴胡皂苷d，柴胡皂苷E，柴胡皂苷G 所對應的化學成分對FST 和TST 不動時間具有較大影響。結合灰度關聯分析和相關分析研究，表明柴胡皂苷d、柴胡皂苷E 和柴胡皂苷G 與藥效的相關性最大，但是其餘未指認的'色譜峰所對應的化學成分是否有抗抑鬱作用，有待於進一歩研究。
4 討論
XYE-E 的1H-NMR 圖譜包含了XYE-E 中所有物質的氫訊號，透過對1H-NMR 指紋圖譜中的特徵峰進行分析，共指認出14 種化合物，包括柴胡皂苷類物質，白朮內酯類物質以及甘草苷、芍藥苷等。
譜效關係研究可以發現和跟蹤藥效物質，指導製備工藝的最佳化，保證中藥的臨床療效。本研究發現與XYE-E 抗抑鬱藥效密切相關的物質主要是柴胡皂苷，甘草苷和芍藥苷與抗抑鬱藥效相關度並不高。採取不同提取分離工藝所得提取物的化學組分和含量均不同，從而引起圖譜特徵資訊變化和相關藥效的改變。
中藥化學組成複雜，單張化學圖譜難以完整地反映中藥的化學組成特徵，因此建立多源譜效關係，完整表徵中藥複方的整體化學特徵顯得尤為重要。本研究中未被指認的色譜峰需進一步分析，對XYE-E 中的化學成分進行更深入的分析和譜效關係研究。
綜上所述，中藥複方譜效關係的研究對於最佳化中藥生產工藝，追蹤和篩選藥效活性成分，加快中藥新藥研究等方面具有重要的推動作用。