蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經元細胞中的保護作用論文

　　研究發現，缺血再灌注損傷是對組織造成損傷的主要因素，即再次恢復血液供應，缺血組織灌注時造成的微血管和實質器官的損傷，本研究旨在探討糖皮質激素誘導的蛋白激酶1( SGK1) 在大腦缺血再灌注過程中可能的保護機制。

　　1 資料和方法

　　1. 1 樣本來源本研究用細胞為培養後的1 日齡SD 大鼠神經元細胞。對SD 大鼠採用椎脫臼處死法處死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min; 取出海馬神經元細胞進行培養。

　　1. 2 試驗方法

　　1. 2. 1 大鼠海馬神經元細胞的額分離及培養選用1 日齡SD大鼠2 只。透過對大鼠進行消毒後處死，獲取了SD 大鼠的海馬細胞，並進行了體外培養。

　　1. 2. 2 已分離培養的SD 大鼠海馬神經元細胞的'免疫熒光鑑定採用海馬神經元特異性抗微管相關蛋白2(MAP2) 抗體免疫熒光來顯示分離和培養的結果，在顯微鏡下計數，記錄每個視野中染色陽性的細胞佔所有細胞的比值，超過95%的為陽性。

　　1. 2. 3 透過氧糖剝奪誘導海馬神經元凋亡將海馬神經元細胞根據氧糖剝奪誘導時間不同分為正常海馬神經元細胞組，氧糖剝奪誘導120 min 組、氧糖剝奪誘導120 min 後正常恢復10 min組、氧糖剝奪誘導120 min 後正常恢復30 min 組和氧糖剝奪誘導120 min 後正常恢復60 min 組。採用Annexin VFITC/PI 流式細胞術對樣品進行檢測，區分實驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞。

　　1. 2. 4 Western 印跡技術檢測上述步驟中各種細胞的SGK1 表達實驗對樣本進行總蛋白提取與定量，根據SGK1 的mRNA序列( 序列號: NM_001193568. 1) 設計了該基因的全基因引物，獲得目的基因SGK1 模板，構建質粒載體，並進行過表達效率檢測。

　　1. 3 統計學方法採用SPSS16. 0 進行分析。

　　2 結果

　　2. 1 氧糖剝奪誘導海馬神經元凋亡及SGK1 表達情況NC 代表未經任何處理的培養過的SD 大鼠海馬神經元細胞、OGD 表示對培養過的SD 大鼠海馬神經元細胞進行了120 min 的氧糖剝奪，而10 min 組、30 min 組和60 min 組則表示培養過的SD 大鼠海馬神經元細胞在進行了120 min 的氧糖剝奪之後分別進行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供給。

　　2. 2 SGK1 基因蛋白水平的過表達能阻止氧糖剝奪120 min 的培養過的SD 大鼠海馬神經元細胞的凋亡與NC 組比較，轉染SGK1 過表達載體的細胞內，可以SGK1 導致mRNA 的表達增加約5 倍; 在轉染了SGK1 過表達病毒載體的細胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表達約超過未處理組的2. 5倍。海馬神經元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體; 在轉染24 h 後，

　　SGK1 在基因水平和蛋白質水平的變化情況和NC 相比具有顯著性差異。海馬神經元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體24 h，然後進行120 min 的氧糖剝奪，然後使之恢復60 min; 運用流式細胞儀分析用膜聯蛋白V/PI 雙染色法來檢測細胞凋亡情況。透過免疫印跡實驗檢測SGK1 和活化的金屬基質蛋白酶(caspase) -3 蛋白水平差異情況。

　　3 討論

　　缺血性腦血管病是目前導致人類，尤其是老年人致死和致殘率最高的疾病之一。對於缺血性腦血管病當前最主要的治療原則是對缺血區域進行血液灌注; 然而近期發現對缺血性腦血管疾病的缺血再灌注非但沒有使組織功能恢復，反而會導致缺血所致的功能障礙和結構破壞進一步加重，這種現象即缺血再灌注損傷，在各種模式生物和人類研究中都得到了一致的結果。

　　本研究結果發現，對體外培養的SD 大鼠海馬神經元細胞進行氧糖剝奪可導致SD 海馬神經元細胞凋亡數量的增加，而之後隨著再恢復氧糖供應時間的增加，神經元細胞凋亡的資料則呈現進一步加劇的趨勢。而SGK1 的過表達則可以抑制SD大鼠海馬神經元細胞因氧糖剝奪導致的細胞凋亡的趨勢。另外本結果顯示，SGK1 的過表達能顯著降低因氧糖剝奪導致的SD 大鼠海馬神經元細胞凋亡的數量，這一結果得到了熒光輔助細胞篩選分析的支援，提示Akt 和GSK-β 可對經受缺血再灌注海馬神經元細胞能起到保護作用。