黃芩有效成分在炎症通路中的作用靶點研究進度論文

　　炎症反應作為一種基本病理過程與許多常見炎症性疾病有著密切的聯絡，並且隨著現代研究的不斷深入，越來越多影響人類健康的疾病如高血壓、糖尿病、癌症等也逐漸被發現與炎症反應有著密切的聯絡。中藥黃芩來源於唇性科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensis 的乾燥根，是一種十分常見的中藥材，在我國有著悠久的使用歷史，它始載於《神農本草經》，性味苦寒，有清熱燥溼之功效，主要用於溼熱證，證見發熱胸痞、食慾不振、小便短少、舌苔黃膩等。黃芩的化學成分有黃酮類、酚酸類、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等。其活性成分主要為黃酮類化合物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、新黃芩素等，研究表明它們都具有一定的抗炎作用，能夠減少腫瘤壞死因子-α( TNF-α) ，白細胞介素-1β( IL-1β) 等重要炎症介質的釋放並且抑制細胞毒性分子一氧化氮( NO) 的產生，從而對機體產生保護作用。近年來透過對黃芩抗炎作用的不斷研究，黃芩有效成分的抗炎作用機制也逐漸被人們所掌握，其中就包括對炎症通路的阻斷作用，黃芩中多種有效成分能夠作用於炎症通路中的關鍵靶蛋白影響其活性從而抑制炎症反應的發生，但在眾多研究中，研究者往往僅從單個蛋白或者單條通路探討黃芩有效成分對其中的影響，缺乏一定的整體性。本文從黃芩有效成分在炎症通路中的作用為出發點，就黃芩有效成分在整個炎症通路中作用的靶蛋白做一個較為全面的總結，為黃芩抗炎作用的進一步研究與應用提供參考。

　　1 對TLR 通路的影響

　　Toll 樣受體蛋白( Toll-like receptors，TLR) 最初是在果蠅體內發現的一種訊號轉導蛋白，在果蠅的發育和免疫反應中有重要的作用。隨著研究的不斷深入，人們發現在哺乳動物體內也同樣存在著Toll 樣受體蛋白，並將這種蛋白統一歸為TLR 家族。它們能夠結合一些病原體或其產物共有的特定分子結構來進行識別，還可以對不同病原體的相關分子結構進行識別繼而引發一系列的訊號轉導，從而導致炎症介質的釋放，並最終啟用獲得性免疫反應。現代研究表明中藥黃芩的有效成分能夠作用於TLR 通路的多個靶蛋白，從而抑制炎症反應，減少炎症介質的釋放。

　　1. 1 對TLR2 和TLR4 蛋白的抑制作用作為TLR

　　家族的一員，TLR2 和TLR4 的啟用可誘導很強的免疫反應，在炎症正反應中起著重要的作用，是天然免疫反應和獲得性免疫反應之間的關鍵連結因子。多項研究表明黃芩苷能夠抑制多種炎症疾病引起的老鼠體內TLR2 和TLR4 蛋白表達升高，並抑制其相關基因的表達。Hou 等在對細胞研究中還證實黃芩苷還能夠減少缺氧引起的大鼠小膠質細胞中TLR4 mRNA 表達上升進而減少TNF-α， IL-1β， IL-6等炎症因子的釋放。另據報道黃芩的另一成分漢黃芩苷也同樣被證實能抑制致炎因子LPS 導致的TLR4 蛋白的異常表達。這些均表明TLR 蛋白可能為黃芩抑制炎症反應的作用靶點。

　　1. 2 對MYD88， IRAK，TAK 蛋白的抑制作用

　　髓樣化因子88( MyD88) 是MyD88 依賴性TLR 訊號通路中的一個主要接頭蛋白，C 端為TIR 結構域，可與白介素-1 受體相關激酶( interleukin-1 receptorassociatedkinase，IRAK) 和白介素-8 受體( IL-8receptor，IL-8R) 的TIR 結構結合，N 端是死亡結構( DD) 負責招募下游具有死亡結構的訊號分子。在TLR 識別相應配體後，MyD88 與TLRs 互相作用，此時MyD88 的C 端TIR 結構與受體結合，N 端的DD結構招募IRAK-1， IRAK-4 和腫瘤壞死因子受體相關蛋白6 ( tumor necrosis factor receptor-associatedfactor 6，TRAF6) 到受體上，使IRAK-1，TRAF-6 活化進而發生磷酸化，而後與MyD88 解離。在TRAF-6和Ubc13 /Uevl A 的共同催化下TRAF6 自身發生泛素化，泛素化的TRAF6 透過轉化生長因子β 啟用激酶( TGF-activated kinase，TAK) 的介導下啟用下游的相關訊號通路調控IL-1， IL-6 和TNF-α 等相關炎症因子的轉錄。Lin 等透過對腎臟缺血模型Wistar 大鼠給予100，10，1mg·kg - 13 種不同劑量黃芩苷，然後使用蛋白質免疫印跡( Western bolt) 技術對大鼠腎臟中MyD88 蛋白分子進行檢測，結果顯示3 種劑量的黃芩苷組對比模型組大鼠體內MyD88蛋白表達量有不同程度的下降，由此證明黃芩苷能夠抑制MyD88 蛋白的表達。與此同時研究人員在對脂多糖( LPS) 致炎的研究過程中進一步發現黃芩苷還能夠抑制LPS 導致的細胞中IRAK1，TAK1 蛋白的表達上升。黃芩也因此可能以MyD88，IRAK，TAK 蛋白作為靶蛋白，阻斷炎症通路，從而減少炎症因子的釋放。

　　2 對促分裂素原活化蛋白激酶( mitogen-activatedprotein kinases，MAPK)

　　通路的影響MAPK 通路是炎症調控中的一個重要訊號通路。這條通路由三類蛋白激酶組成，包括MAP 激酶，MAPK 激酶以及MEK 激酶，透過這三類蛋白的依次磷酸化訊號就從上游傳遞至下游的應答分子產生相應的應答反應。透過現代研究，筆者又在哺乳動物的體內發現了細胞外調節蛋白激酶( extracellular regulated protein kinases，ERK) ，c-junN 端激酶( c-jun N-terminal kinase， JNK) ，P38MAPK等五種不同的MAPK 訊號通路，它們參與應激刺激、細菌產物、炎症介質等引起的細胞反應，因此MAPK 的啟用與炎症反也有著密切關係。

　　2. 1 對Raf，MEK1 /2 以及ERK1 /2 蛋白的抑制作用

　　Raf 是ERK 通路中一個相對分子質量為40 ～75 kD 的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為一種MEK 激酶。當細胞外刺激與相應受體結合後Ras 活化，活化的Ras 作為銜接蛋白與Raf 結合，將Raf 由原來的細胞質中轉移到細胞膜上。Raf 被Raf 激酶啟用然後與MAPK 激酶MEK 蛋白結合，從而使MEK 啟用，而MEK 的啟用又能夠活化ERK 進而影響相關蛋白的轉錄表達。有明確報道顯示中藥黃芩中的有效成分黃芩素能夠抑制c6 大鼠神經膠質瘤細胞中Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白的磷酸化表達升高，提示了黃芩以Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白作為靶點作用於炎症通路的可能。在有關人類HCC 細胞系mhcc97h 癌細胞的實驗中Chen 等證實，不同濃度的`黃芩素均能夠抑制癌症細胞中ERK1 /2 的磷酸化上升。為黃芩透過ERK1 /2 為靶蛋白作用於炎症反應又提供了新的依據。

　　2. 2 對c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminalkinase，JNK)

　　蛋白的抑制作用JNK 作為MAPKs 家族中的一員同樣能夠被環境中的各種應激因素所啟用。啟用的JNK 可調控許多基因的半衰期，從而增強這些基因mRNA 的翻譯過程，從而對蛋白的表達進行調控。Luo 等的研究還表明，在使用LPS 刺激人類口腔黏膜角朊細胞( Hoks) 後細胞中JNK 蛋白的磷酸化明顯上升，然而使用黃芩苷對細胞進行與處理後LPS 引起的細胞中各個時間段上的JNK蛋白磷酸化上升得到了很好的抑制，並透過ELISA技術檢測分析進一步發現相關炎症因子IL-6， IL-8等表達量對比未給藥組明顯減少。證實了JNK 為中藥黃芩在炎症通路上的作用靶點的可能性。在此基礎上研究者透過初級星行角質細胞，RAW264. 7小鼠巨噬細胞的細胞試驗以及癲癇大鼠黃芩的體外實驗中進一步證明了此結論。

　　2. 3 對p38 蛋白的抑制作用

　　p38MAPK 是MAPK家族控制炎症反應的重要成員，它可以受各種應激刺激而被啟用。當p38 被啟用後會發生核轉位進而使多種蛋白激酶和轉錄因子磷酸化和啟用，因此筆者可以透過抑制p38 蛋白的表達與磷酸化，來對炎症反應進行抑制。在人類風溼性關節炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 細胞中，細胞因受到應急刺激p38蛋白被啟用，其磷酸化水平因此發生升高。Chen等採用黃芩素干預培養人類風溼性關節炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 後，透過Western blot 檢測技術對p38 蛋白磷酸化變化進行檢測。結果證明黃芩素能夠有效的減少p38 磷酸化表達上升，從而阻斷炎症通路減少炎症因子IL-1β 的釋放，抑制炎症反應的發生。並且這種抑制作用在體外動物實驗方面也表現出了相同的趨勢。Mao 等對癲癇大鼠連續給予黃芩素後對大鼠體內p38 磷酸化蛋白進行檢測，結果顯示，黃芩素給藥組對比模型組大鼠體內p38 磷酸化水平出現降低。並且中藥黃芩的另一種重要成分漢黃芩素對p38 磷酸化的抑制作用也被研究者發現證實。

　　3 對核因子-κB( NF-κB) 通路的影響

　　NF-κB 蛋白家族是近年來轉錄因子家族中的新成員，是細胞內重要的核轉錄因子，它幾乎存在與所有型別的動物細胞中並能夠參與細胞的各種應急刺激，包括炎症性刺激。在之後研究中筆者又進一步發現了p50，p52，p65，c-Rel 等其他NF-κB 家族成員。NF-κB 蛋白家族成員之間能夠形成多種形式的二聚體。在非活狀態下NF-κB 與IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ 結合的穩定三聚體) 或前體蛋白聚合的二聚體存在與細胞漿中，當收到多種因素的刺激後IKB 三聚體降解，使NF-κB 上的核定位訊號暴露，NF-κB 發生轉核。與調控基因啟動子上的KB 位點結合後啟動基因轉錄。研究人員透過使用LPS 刺激雄性ICR 小鼠後發現小鼠體內p50 的表達得到上調，而後對疾病小鼠給與10 mg·kg - 1·d - 1黃芩苷進行治療，3d 後透過對比發現p50 的上調錶達對比未給藥組表現出明顯的降低趨勢。於此同時Chen 等也透過實驗發現黃芩中的另一成分黃芩素還能夠降低人類直腸癌細胞HCT116 中p50 蛋白的表達上升。與p50 結合形成二聚體的另一種蛋白p65 則有大量的文獻報道指出，黃芩中的多種成分不僅僅能夠能夠影響p65 的蛋白表達，並且對其磷酸化、入核都有著重要的影響作用。從中也顯示出黃芩有效成分透過影響NF-κB 蛋白二聚體來抑制炎症反應的一個重要線索。與NF-κB蛋白二聚體結合的IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ結合的穩定三聚體) 對於炎症訊號的傳遞也同樣有著重要的作用，研究者透過進一步的實驗發現中藥黃芩中的黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素，對炎症通路中IKKα， IKKβ 的磷酸化都有著良好的抑制作用。因此筆者猜測黃芩中的多種有效成分可以以NF-κB通路中的多個蛋白為靶點抑制炎症訊號的傳遞，減少炎症介質的產生，從而緩解炎症反應。

　　4 對酪氨酸激酶( janus kinase，JAK)

　　轉錄因子( STAT) 通路的影響JAK-STAT 訊號通路是一條受細胞因子刺激而發生傳導的訊號轉導通路之一。它能夠參與細胞的很多重要的生物學過程，例如細胞的增殖、炎症反應的調節等。與其他訊號通路相比， JAK-STAT 訊號通路的傳遞過程相對比較簡單。主要有3 個主要的過程成，首先當相應受體與細胞因子結合後受體分子發生二聚化，然後與受體偶聯的JAK 相互接近並透過互動的酪氨酸磷酸化作用而發生活化使JAK啟用，最後，激酶JAK 催化結合在受體上的STAT 蛋白髮生磷酸化修飾，活化的STAT 蛋白以二聚體的形式進入細胞核內與靶基因結合，調控基因的轉錄。Qi 等人在有關LPS 刺激RAW264. 7 小鼠巨噬細胞的實驗中證實，使用20，40，50 μmol·L - 1黃芩素處理培養細胞24 h 後，細胞對於LPS 引起的JAK1 /2 磷酸化上升與STST1 /3 磷酸化上升都有著抵抗作用。從中表現出黃芩素以JAK 蛋白與STTA蛋白為靶點的一些線索。

　　5 結語與展望

　　黃芩作為傳統中藥材其有效成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、都已被證實具有抗炎作用，並且隨著對黃芩有效成分抗炎作用研究的不斷深入，黃芩在炎症通路中的作用也逐漸被人們所關注，對其作用靶蛋白的描述也逐漸增多，但對於作用於靶蛋白的機制以及作用於靶蛋白強弱的研究仍然甚少，並且研究僅停留在對單個靶蛋白或者單條通路的研究上，缺乏對整個炎症通路作用的研究總結以及比較，但這一部分對於進一步闡明中藥黃芩抗炎作用機理有著關鍵的作用，研究者仍需進一步努力，對黃芩抗炎的作用機理進一步挖掘，為黃芩現代化研究以及新藥研發提供依據。