生物正交氧化還原體系的構建及意義論文

　　細胞內代謝過程除以碳骨架結構改變為主的物質轉化外，通常還伴隨輔因子介導的能量轉移。物質轉化和能量轉移高度耦合，顯著增加了代謝系統的複雜度。氧化還原輔因子透過在氧化態和還原態之間迴圈再生傳遞電子，將物質轉化途徑關聯成複雜的代謝網路[1]. 據不完全統計，在微生物中僅吡啶核苷酸輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate）， NAD（P））及其還原態參與的生化反應就超過 1000 種[2], 這還不包括它們參與的其他生物學過程。傳統生物化學研究提供了大量生物學元件[3,4],系統生物學研究建立了各種代謝模型[5,6], 分子生物學發展提供了有效的遺傳操作方法，使設計和構建新的高效、受控的物質轉化途徑成為可能。然而，輔因子在代謝網路中的節點作用使各種生化反應建立起復雜的相互作用網路，極大地影響了外源途徑在底盤細胞代謝環境中的功能。以氧化還原代謝為例，新途徑可能破壞宿主內源氧化還原平衡，從而抑制生長，使新途徑難以產生預期效果[7]. 人工構建的外源途徑對底盤細胞中天然代謝網路的相互干擾，特別是氧化還原環境的干擾，是影響外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要因素。透過調節胞內輔因子水平，如控制酶的表達水平、最佳化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競爭代謝途徑等，可以最佳化外源途徑與底盤細胞的適配性，在一定程度上提高代謝調控效率[8~10]. 但輔因子擾動的生物學效應的可控性和可預見性低。例如，琥珀酸生產需要維持胞內較高 NADH 水平，但高 NADH 水平影響菌株對培養條件的適應性[11]. 設計脂肪酸生產菌株時需要使脂肪酸合成途徑與宿主 NADPH 供給能力相匹配，但由於無法確定擾動 NADPH 水平對代謝造成的全域性性影響，無法預測合適的外源基因表達強度，需要篩選不同表達強度的啟動子表達外源基因[12]. 輔因子關聯作用導致的複雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。例如，在大腸桿菌（Escherichia coli）中構建的高效丁醇合成途徑 , 移植到藍細菌（Cyanobacteria）中就難以達到積累丁醇的效果，因為藍細菌傾向於積累 NADPH 而非 NADH[13,14].

　　因此，提高人工代謝途徑在底盤細胞中的適配性、可預見性和可移植性需要降低代謝系統，特別是輔因子依賴型氧化還原系統的複雜度。

　　1 正交氧化還原體系

　　為降低代謝系統複雜度，可設計獨立於生長代謝的合成途徑及獨立的輔因子迴圈再生體系。這種在複雜代謝體系中執行系統子功能，並且其執行過程獨立於系統其他元件的子系統稱為正交體系。正交體系的設計構建過程即“正交化”[15]. 正交氧化還原體系是指電子傳遞獨立於系統其他氧化還原輔因子系統的一種氧化還原體系。目前主要有兩種策略可用於構建正交氧化還原體系：（ⅰ）在空間上分隔輔因子依賴型體系，即“空間正交氧化還原體系”; （ⅱ）構建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系，即“生物正交氧化還原體系”[8,15]. 設計構建正交氧化還原體系，是減少外源途徑對底盤細胞中天然代謝網路的干擾，提高外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要策略。以下綜述正交氧化還原體系的設計和應用特點。

　　2 空間正交氧化還原體系

　　空間正交氧化還原體系透過將相關的酶及輔因子限定在特定區域，提高區域性底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統的相互作用[16,17], 目前主要透過構建融合蛋白和設計蛋白錨定支架實現，並已有多個成功應用的報道。另外，最近發現，細胞內可形成一些特殊的微區室（microcompartment），可以有效限制輔因子或代謝中間體擴散，從而避免胞內輔因子水平干擾微區室內氧化還原代謝[18,19]. 利用微區室也可構建空間正交氧化還原體系[15].

　　蛋白融合技術透過基因工程手段將多個酶用短肽序列連線形成融合蛋白，透過調整連線肽特性和酶的連線方向控制酶的空間定位（圖 1A），最佳化級聯催化過程中底物和能量傳遞[20]. 蛋白錨定支架技術透過調整支架上的錨定位點距離、各種錨定位點的數量和連線肽特性 3 種方式調整酶的空間定位和比例（圖 1B），可降低代謝網路對目標途徑的影響，提高目標途徑底物和輔因子的區域性濃度，減少與環境的相互影響[21].

　　兩種空間正交氧化還原體系構建策略都受到連線肽特性的影響，由於連線肽及蛋白結構和功能的多樣性，需要透過篩選確定合適的連線肽柔性和長度，最佳化酶的空間定位[2,22]. 連線肽通常使用柔性序列 GGGGS（G4S）[23~26], 透過調整其複製數改變連線肽長度，但有時利用剛性氨基酸延長連線肽效果更好，如將惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）細胞色素 P450（P450cam）、假單胞氧還蛋白（putidaredoxin,P d X ）和假單胞氧還蛋白還原酶（ p u t i d a r e d o x i nreductase, PdR）分別與硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的增殖細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen, PCNA）融合時，比較兩組連線肽G4S-（P5）n-G4S（n=1~5）和（G4S）n（n=1~6）效果，以 G4S-（P5）4-G4S 連線時活性最高（（6.5±0.3） μmol/（L min）），而（G4S）n（n=1~6）最高活性（G4S）5約為 5 μmol/（L min）[22].相比於柔性，調節連線肽長度效果通常更顯著，上述例項中最適連線肽長度對應活性比 n=1 時提高兩倍。

　　長度選擇也是最常見的連線肽最佳化方式。在 P450 單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC, 催化桉樹醇轉化為 2-羥基-桉樹醇，發現當連線肽長度為10 個氨基酸時產量最高，少於 4 個氨基酸時檢測不到催化活性[2].

　　除了連線肽特性，空間正交氧化還原體系構建還需要綜合最佳化多種因素以在提高體系獨立性的同時獲得更好的催化活性。構建融合蛋白要考慮融合方向對催化效率的影響 . 將丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）來源的氫酶（hydrogenase,H2ase）融合鐵氧還蛋白（ferredoxin, FD）促進產氫時，用 2 個氨基酸殘基連線時， FD 連在 H2ase 的 C-末端對產氫過程無促進作用，而連在 N-末端氫氣產量提高約 3 倍[26]. 這是因為 H2ase 與 FD 作用位點在氫酶N-末端， N-末端融合更利於兩個蛋白相互作用。這種融合蛋白組合的催化效率也受連線肽長度的影響，以14個氨基酸殘基連線效果最好，產氫效率提高近5倍，延長至 46 個氨基酸殘基幾乎沒有促進作用[26].

　　與蛋白融合技術相比蛋白錨定支架技術可更自如地設計酶的空間分佈和計量關係[27,28]. 仍以上述H2ase 與 FD 生物轉化產氫途徑為例：將真核訊號轉導相關的 PDZ（postsynaptic density protein of 95kilodaltons, disc large, zona occludens-1）， SH3（sarcoma homology 3）和 GBD（gelatin binding domain）3 種結構域整合到支架蛋白上，透過配體肽段將催化生物合成的酶特異性結合到支架蛋白的對應位置，這種設計可以透過調整 H2ase 和 FD 在支架上的結合位置、酶與支架配體間連線肽的長度、結合域數量等調整酶的空間分佈與比例[26]. 結合域在支架上間距靠近時產氫效率高；結合域相對位置相同， FD 與支架蛋配體白的連線肽長度分別為 10, 20, 40 個氨基酸時，延長肽鏈長度可使氫氣產量提高 3~5 倍；透過調整支架蛋白上的 PDZ, SH3 和 GBD 結合域比例調整FD:H2ase 比率，比率越小產氫效率越高[26].

　　除了蛋白， DNA, RNA 等大分子也可作為蛋白錨定支架[20,29,30], 並且隨著 DNA 合成技術發展及對DNA, RNA 結構預測能力的提高，基於核酸的支架受到更多重視。利用 DNA 整合 NAD（P）H: 黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）氧化還原酶和熒光素酶，還原力 NADH 經過 NAD（P）H:FMN 氧化還原酶傳遞給 FMN, 然後傳遞給熒光素酶，與分別連在兩條不同 DNA 鏈上的遊離狀態相比，連在同一 DNA鏈上時活性提高到 2~3 倍[31]. 支架可以是單個分子，也可以是可自組裝的蛋白亞基。如將前述 P450cam,PdX, PdR 和亞磷酸脫氫酶分別與 PCNA 融合時，構建融合蛋白 PCNA-PdR, PCNA-P450cam 和 PTDH-PCNA-PdX, 3 個融合蛋白的 PCNA 亞基透過自組裝形成三聚體將 4 個酶進行空間整合，促進反應中的電子傳遞，組裝複合體比遊離酶催化速率提高 2 倍[22,32].

　　以上空間正交氧化還原體系的應用表明，透過減少天然氧化還原體系的干擾，可以有效提高目標氧化還原體系的效率和可預見性。

　　3 生物正交氧化還原體系

　　空間正交氧化還原體系透過限制環境因素對體系的影響提高催化效率和可控性，仍然難以避免天然輔因子與底盤細胞中天然代謝網路的相互影響。如果突破相應生物化學反應對天然輔因子的依賴，建立生物正交氧化還原體系，將可能從根本上解決能量特異性傳遞問題。

　　3.1 生物正交氧化還原體系構建

　　構建生物正交氧化還原體系，需要合成不被天然代謝系統識別的人工輔因子，並獲得特異性識別人工輔因子的突變型酶，組成具有催化功能的配對[15,33].利用蛋白工程和化學生物學方法，構建獨立於天然生物反應的非天然配體/受體配對，即生物正交體系，已取得過一些降低生物體系複雜度的成功例子[34,35].

　　生物正交的配體/受體配對設計策略可分為兩種：（ⅰ）策略以配體改造為中心，即先改造受體並篩選獲得不識別天然配體的新受體，再合成具有一定結構多樣性的配體類似物文庫，然後篩選得到該新受體與特定配體類似物配對的功能組合；（ⅱ）策略以受體改造為中心，即先選定一種不被天然受體利用的配體類似物，再構建受體文庫，然後篩選得到該配體類似物與新受體的配對功能組合[36].

　　以設計篩選 NAD 類似物-依賴型氧化還原酶為例，說明正交氧化還原體系構建過程[33]. 對於 NAD分子，可認為由單磷酸腺苷（adenosine monopho-sphate, AMP）和煙醯胺單核苷酸（nicotinamidemononucleotide, NMN）兩部分組成（圖 2A），其中NMN 參與電子傳遞，而 AMP 部分參與分子識別，對輔因子特異性有重要影響[37]. 改造 NAD 結構的腺嘌呤環部分，可在保留電子傳遞功能的同時改變其與受體相互作用。因此，以其他雜環代替腺嘌呤環部分合成一系列 NAD 類似物，同時以 NAD 依賴型蘋果酸酶（malic enzyme, ME）為例構建其突變體表達文庫。利用以上合成的特定NAD類似物為輔因子，篩選ME突變體文庫，得到具有催化活性的功能配對[33,38,39].

　　以 5-氟代胞嘧啶環代替腺嘌呤環的類似物煙醯胺氟代胞嘧啶二核苷酸（nicotinamide flucytosinedinucleotide, NFCD）（圖 2B）為輔因子，野生型 ME 催化效率僅為以 NAD 為輔因子時的 0.93%. 在 ME 突變文庫中篩選利用 NFCD 的突變體 ME*（MEL310R/Q401C）， ME*以 NFCD 為輔因子的`催化效率與野生型組合相當，而以 NAD 為輔因子的催化效率僅為以 NFCD 為輔因子的 0.37%. 而且， ME*保留了對底物蘋果酸的立體選擇性。因此， ME*-NFCD 組合可作為生物正交化氧化還原體系執行天然的ME-NAD 體系的催化功能[33]. 進一步合成了其他NAD 類似物（圖 3B），發現 ME*與 NBrCD 配對的催化效率可達到野生型配對催化活性的 73%. 表明 NAD類似物與 ME*組成的配對可達到與天然體系相近的催化效率，即構建了不依賴天然輔因子的正交氧化還原體系[39].

　　基於NFCD類似物（NFCD analog, NXCD）的正交氧化還原體系構建策略具有可擴充套件性。氧化還原酶與 NAD 的結合區域通常具有保守的 Rossmann 摺疊結構[40]. ME*的關鍵突變位點 L310 位於其保守序列GX（X）GXXG 的 N-末端，對蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的相應保守位點的氨基酸進行定點突變，均獲得了偏好 NFCD 的突變體[33]. 說明同樣的突變策略可應用於改造其他吡啶核苷酸輔酶依賴型氧化還原酶，構建相應的正交反應體系。

　　構建生物正交氧化還原體系的難點在於設計篩選生物正交的配體-蛋白組合。雖然不斷完善的配體-蛋白組合輔助設計工具降低了工作難度[41~43], 獲取高活性配體-蛋白組合仍需高通量篩選策略[44]. 由於氧化還原酶具有較高的結構保守性[40], 識別 NAD 類似物所蘊涵的資訊可用於指導改造其他氧化還原酶。目前使用的 NXCD 系列類似物合成成本較高，使用過程中可以選擇迴圈再生策略降低使用成本[33].

　　3.2 生物正交氧化還原體系的應用

　　由於正交氧化還原體系獨立於天然輔因子迴圈體系，可進行途徑特異性還原力傳遞，因此理論上可用表達突變型功能酶的粗酶液進行選擇性生物轉化。

　　以大腸桿菌細胞裂解液催化轉化蘋果酸生產丙酮酸為例，對於表達野生蘋果酸酶的體系，在 NAD 存在下，蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸並伴生NADH[45]. 而內源的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）以NADH 為輔因子，進一步將丙酮酸還原為乳酸（圖3A）。丙酮酸和乳酸收率分別為 70%和 26%, 即 26%丙酮酸被轉化成乳酸。而利用過表達 ME*的粗酶液在外加 NFCD 的條件下，丙酮酸收率達到 79%時，乳酸收率僅為 5%. 這是因為，內源乳酸脫氫酶難以利用 NFCDH 為輔因子還原丙酮酸（圖 3B）。

　　可見，利用生物正交氧化還原體系，可以使電子特異性地在該體系內部傳遞，避免與內源途徑相互干擾，提高體系效率的同時排除副反應。這一特性表明正交氧化還原體系可降低外源途徑與底盤細胞中天然代謝網路的相互干擾，提高外源合成途徑與底盤細胞適配性。由於目前還沒有在胞內檢測到NXCD 的相關報道，應用正交氧化還原體系需要解決將 NXCD 匯入胞內的問題。透過化學合成獲得NXCD, 再利用細胞透性化技術或轉運蛋白[48~50]可將 NXCD 匯入細胞。

　　作者近期利用擬南芥（Arabidopsis thaliana）來源的 NAD 轉運蛋白[50]將胞外 NCD 匯入大腸桿菌工程菌，成功地在胞內構建生物正交氧化還原體系[51]. 該體系利用突變型亞磷酸脫氫酶氧化亞磷酸再生NCDH, NCDH 特異性推動 ME*催化丙酮酸還原羧化產生蘋果酸[51,52]. 而對於天然體系，由於 NADH 被天然代謝系統消耗， ME利用NAD催化蘋果酸氧化脫羧反應。這些結果表明，基於 NCD 的正交體系可有效避免與天然體系相互干擾，選擇性傳遞氧化還原力。正交氧化還原體系的應用將顯著提高外源合成途徑與底盤細胞適配性。

　　4 展望

　　正交氧化還原體系對提高輔因子調控效率和可預見性具有重要意義，有利於提高外源合成途徑與底盤細胞適配性。可透過空間正交化和生物正交化兩種策略構建正交氧化還原體系。其中空間正交化策略在空間上隔離輔因子依賴型代謝反應，其推廣應用依賴於發現更高效的蛋白錨定支架系統或組裝新的微區室。生物正交化策略可從根本上解決輔因子依賴型反應相互干擾的問題，是輔因子調控技術發展的重要方向，其發展依賴於分子間相互作用的分析設計能力和配體/受體組合的篩選能力，以獲得功能更豐富的生物正交氧化還原體系，並提高生物正交特異性。其中在 NCD 基礎上設計煙醯胺胞嘧啶二核苷酸磷酸（nicotinamide cytosine dinucleotidephosphate, NCDP）化學合成或生物合成途徑，並篩選構建 NCDP-功能酶正交組合，將極大地提高生物正交氧化還原體系元件的設計構建效率，提供多種輔因子水平和氧化還原狀態選擇，為基於生物正交氧化還原體系的代謝途徑設計提供更廣闊的應用和研究空間。

　　正交氧化還原體系提供了一種提高胞內輔因子調控效率和可預見性的新思路，與其他工程策略組合使用，對設計微生物細胞工廠乃至生命系統具有重要價值。

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