開口箭活性部位抗腫瘤細胞作用研究論文

　　1 材料與儀器

　　1.1 細胞株人宮頸癌細胞（Hela）、人肝癌細胞（HepG2）均由三峽大學分子生物學研究所提供。

　　1.2 藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產品；HEPES為美國Sigma公司產品；胰蛋白酶為美國GIBCO公司產品；四氮唑藍（MTT）為美國AMRESCO公司產品；環磷醯胺（CP,江蘇恆瑞醫藥股份有限公司，批號：07020121）。酶聯免疫檢測儀（GENIOS TECAN）；CO2培養箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機（北京醫用離心機廠）；96孔板（美國Cornning公司）。開口箭根莖於2002-07採自湖北省神農架林區，經三峽大學化學與生命科學學院陳發菊副教授鑑定為Tupistra chinensis Bak.，標本存放於湖北省天然產物研究與利用重點實驗室（No.TC200207SNJ）。

　　2 方法

　　2.1 藥物製備開口箭根莖粉碎後，用甲醇迴流提取，合併提取液，濃縮後經氯仿脫脂後用水飽和的正丁醇萃取，旋轉蒸發回收正丁醇，濃縮液抽乾後即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開口箭4部分皂苷。分別取開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷兩個樣品，用PBS配製成所需濃度，依次為312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%開口箭皂苷用PBS配製成所需濃度，依次為156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受試樣品均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。環磷醯胺（CP）用DMSO將其配置為500 mg/ml。

　　2.2 細胞培養 Hela和HepG2細胞用RPMI-1640培養液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素和10%新生小牛血清），於CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和溼度下培養。貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

　　2.3 開口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇MTT法實驗條件的初步最佳化，主要是對溶解藥物的.溶劑（水、PBS）、加藥前的培養時間（6，12，24 h）、藥物劑量和細胞密度進行了摸索。其中密度細胞分別取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個/ml,接種於96孔培養板，每孔接種100 μl，轉板24 h後加不同濃度的開口箭活性部位，繼續培養48 h，以MTT法測定吸光度，比較不同細胞密度的線性關係。

　　2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改進。將處於對數生長期的細胞製成單細胞懸液，調整細胞濃度為0.5×105個/ml,接種於96孔培養板，每孔接種100 μl，轉板24 h後加100 μl受試藥，另設陰性對照組（不加藥）、空白調零組（只有PBS）和陽性對照組（環磷醯胺組），每組均設3個復孔，培養48 h，吸棄上清後加MTT（5 mg/ml）100 μl,繼續培養4 h後，棄去上清液，加DMSO 100 μl,用全自動酶聯免疫檢測儀於570 nm波長處測定吸光度（OD）值［7］，求出IC50。抑制率（%）=［陰性對照A570- 加藥組A570］/ 陰性對照A570×100%。

　　2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞週期分1×106個細胞於培養瓶，陰性對照組0.5×106個細胞每瓶，培養24 h；吸棄部分上清後加藥混勻（開口箭總皂苷、30%皂苷終濃度2 500μg/ml，70%皂苷和環磷醯胺終濃度1 250 μg/ml），繼續培養48 h；於5%CO2培養箱中培養48 h後，收集上清於相應標籤離心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培養液於該培養瓶中，並一起吸至各相應離心管中，各瓶加入5 ml PBS洗滌，洗滌液一起吸入相應離心管中，以2 000 r/min離心5 min；吸棄上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA（Na）2的PBS混合液懸起細胞，輕輕混勻，於4℃固定30 min；棄上清，加PBS 10 ml混勻，以2 000 r/min離心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS懸起細胞，轉置測定管中，加溴化丙錠PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；濾膜過濾後上機。

　　3 結果

　　開口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇為了得到相對穩定並且可靠的實驗結果，透過前期預實驗並結合大量資料，對該MTT法實驗條件進行了初步最佳化，主要是對溶解藥物的溶劑、加藥前的培養時間、藥物劑量和細胞密度進行了探索。對於溶劑，最初採用的溶劑是水，透過對照發現溶解藥物的水對細胞的影響很小，但並非沒有，所以正式實驗採用PBS溶解藥物；對於加藥前的培養時間採用了6，12，24 h 3個時間，透過顯微鏡觀察發現加藥前培養24 h細胞狀態良好，由此選用了加藥前培養24 h；

　　對於藥物劑量，透過多次預實驗，最終選擇了最高濃度開口箭總皂苷、30%皂苷為10 000 μg/ml，70%皂苷為5 000 μg/ml，而環磷醯胺為20 000 μg/ml；對於細胞密度，透過多次預實驗，採用5種細胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個/ml，同樣的藥物濃度情況下，開口箭活性部位對Hela細胞生長抑制呈最好線性關係的細胞密度是0.5×105 個/ ml，由此選擇最佳細胞濃度是0.5×105個/ml。透過這些因素的最佳化，從而初步排除了其他非藥物因素對細胞的影響；而且這兩種腫瘤細胞的MTT實驗在同一批進行實驗，排除了不同環境的干擾，從而得出實驗結果。