天然產物化學課件
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1. 分子印跡技術和固相萃取的原理
1.1 分子印跡技術
分子印跡技術(MIT)是近十幾年來發展起來的一門邊緣科學技術,是指製備對某一特定目標分子具有特異選擇性的聚合物-分子印跡聚合物(MIPs)的過程,它結合了高分子化學、生物化學等學科,作為一種新型高效的分離技術,具有空間專一識別性。
1.2 固相萃取
固相萃取(SPE)是利用固體吸附劑對液體試樣中各組分吸附力差異而實現分離的。固相吸附劑對目標組分的選擇性越高,則分離效率越高。混合液透過吸附柱時,目標成分被吸附劑吸附,然後再利用洗脫液洗脫或加熱解析,達到富集目標化合物的目的。根據目標化合物的種類、性質等選擇合適的固相萃取劑和洗脫液及其它最佳化條件後,可以一步完成萃取、富集、淨化等操作,並可以與高效液相色譜、氣相色譜等聯用。固相萃取克服了一般液液萃取及一般層析柱的缺點。萃取過程簡單快速、節省溶劑、重現性好、回收率高、減少了有機溶劑對操作人員和環境的影響。
2. 分子印跡固相萃取高效液相色譜
2.1 SPE-HPLC 聯用技術
MIPs 用作 SPE 的填料用來分離富集複雜樣品中的分析物，具有以下優點：
（1）化學和物理穩定性。MIPs 機械強度高，耐高溫、耐高壓，能抵抗酸、鹼、高濃度離子、有機溶劑的作用，在複雜化學環境中能保持自身穩定性
（2）能夠反覆使用。已由文獻證明 MIPs 反覆使用 300 次之後印跡能力也未發生衰減
（3）穩定性好。有報道稱儲存 8 個月之後其效能也不會發生改變Sellergren 等首先報道了 MIP - SPE（MISPE），應用合成的戊烷分子印跡聚合物填充小柱，成功分離了尿中的潘他米丁，不用色譜分析便直接在解吸附後檢測出了結果。其後，更多關於 MISPE 的研究在不同領域得到了發展。具體固相萃取可以分為離線固相萃取和線上固相萃取兩種方法。
2.2 線上固相萃取
為了克服離線 MISPE 的缺點，發展出了線上MISPE 方法。這種方法實現了 MISPE 與分析系統的自動化操作，由此避免了預富集和分析步驟間的樣品操作，因此減弱了分析物的損失，被汙染的危險，增加了靈敏度和重現性。同時，由於
MISPE 過程實現了自動化，可以大大減少處理樣品的時間。另外，整個樣品提取在分析柱中進行，所以樣品的用量可以更少。一般採用普通的六通閥與 HPLC 聯用，填料裝於不鏽鋼小柱中，以適應 HPLC 系統的高壓
2.3 離線模式
目前,MISPE採用最多的還是離線模式,這種模式操作簡單,可選用的溶劑和新增劑較多,並且不用考慮它們對分析的影響,因此,有更高的富集率和選擇性。其不足在於檢測時間長,會相應增大誤差。離線模式一般分為4個步驟:平衡、上樣、清洗和洗脫。
2.4.1 固相萃取中分子印跡聚合物的製備
分子印跡聚合物的製備通常包括以下幾個步驟:功能單體與模板分子的功能基團在適當的條件下可逆結合,形成複合物;加入交聯劑,使其與功能單體聚合,形成的聚合物將模板分子包埋在內;用物理和化學方法,將模板分子從聚合物中洗脫,以獲得具有識別功能並與之相匹配的三維空穴.
2.4.2模板分子與功能單體的相互作用
模板分子與功能單體之間的相互作用也可稱之為印跡,主要有共價印跡、非共價印跡和半共價印跡3種方式。非共價印跡過程中,模板分子和功能單體透過氫鍵、靜電相互作用、範德華力、疏水作用等非共價鍵作用結合形成複合物。此種方式形成速率快,也容易從複合物中去除模板分子,有較廣泛的模板分子選擇範圍,故有較大應用潛力。但是,此種方式印跡製備的分子印跡聚合物(MIPs)結合位點不均一,容易引起模板分子滲漏現象。共價印跡在固相萃取中很少應用。第三種是半共價印跡,這種方式是分子印跡聚合物用共價鍵印跡製備,而分子印跡聚合物與待測物質之間僅僅依靠非共價鍵作用來結合,這樣,即能發揮它們的特長,又克服了彼此的不足
3 . 分子印跡固相萃取的應用
3.1 環境試樣分析中的應用
環境試樣的分析是環境保護中的一個重要環節,起著重要的作用。MISPE作為一種新的`高效分離方法,在環境樣品的分析中已得到廣泛應用。Antonio等製備了24種分子印跡聚合物,用於土壤中BPA的固相萃取研究。Zhang Jiang-hua等用沉澱聚合法制備分子印跡聚合物,並在最佳化的條件下探討了人血清、豬尿、自來水和蝦等4種試樣中雙酚A(BPA)的固相萃取。Nuria等用高效液相色譜法線上反相固相萃取系統研究了含有11種痕量酚類物質的標準水樣,選擇性地富集和萃取了4-硝基苯酚。己烯雌酚是一種雌激素物質,存在量極少,難於富集及分析。
3.2 食品分析中的應用
食品中有害物質或微生物的含量一般都很低,當其含量低於方法的檢出限而又高於允許含量標準時,就必須對其進行提取和富集操作後,才能進行定量檢測,
並制定相應的食品安全標準。MISPE能有效地對樣品進行提取和富集,提高了檢測裝置靈敏度,有利於建立更嚴格、更完善的食品安全標準。Robert等探討了不同模板對分子印跡聚合物識別性的影響,用MISPE分析了葡萄酒樣品中櫟精以及相關的黃酮類物質,為葡萄酒的預處理提供了一種快捷方便的方法。念珠鐮刀菌素是一種低相對分子質量的毒枝菌素,需要一些能在分子水平上識別念珠鐮刀菌素的物質。
3.3 生物醫學方面的應用
生物醫藥試樣的檢測大多是針對痕量物質的富集和分離,且要求檢測過程精確、快速、高效,MI-SPE適應了這一要求。在人的血漿、血清及各組織中有害物質的檢測和分析方面,MISPE取得了不少進展。Zoe等與Andersson等分別以布比卡因和布比卡因的結構類似物為模板合成分子印跡聚合物,分析了人類血漿中的羅哌卡因和布比卡因。Tang等研究了MISPE對人類血漿和血清中頭孢硫脒的富集、分離,回收率達到了98%。曹璽珉等製備了環丙沙星分子印跡聚合物,研究結果表明:該印跡聚合物具有良好的分子識別效能
4. 未來展望：
SPE-HPLC 具有選擇性好、穩定、可以重複使用且造價比較低等特點,因此,廣泛應用於環境、生物醫藥、食品等試樣中分析物的富集或去除。但是,此種技術還有很多方面需要改進。例如,分子印跡聚合物合成過程中印跡和聚合的方式,模板分子滲漏現象,固相萃取複雜樣品中生物大分子目前還非常少等。另外,MISPE將會與更多的儀器聯用,發展成為一種更好的線上快速檢測方法。總之,隨著技術的不斷髮展和完善,MISPE將會成為一種高效、簡便、快捷的分析工具。