詳談RGD肽段連線的近紅外量子點對小鼠的毒性作用論文

　　目前功能化的量子點(quantum dots，QDs)探針已在細胞和生物分子標記示蹤、活體腫瘤成像、藥物監測、訊號轉導和生物晶片等生物醫學研究領域顯示出極其重要的作用。但由於QDs核的成分為重金屬(如Cd、Se等)，其生物毒性和生物安全性引起了人們的廣泛關注。有研究表明：由於QDs核的重金屬離子釋放以及作為奈米粒的QDs具有誘導細胞產生活性氧自由基，從而對機體和細胞產生毒性作用。但另外一些研究表明：一些表面包裹有生物活性物質的功能化QDs，在體外和體內均未觀察到對細胞或機體的毒性作用。已有研究證實：影響功能化QDs毒性的因素很多，包括QDs核的成分組成、粒徑大小、暴露濃度、暴露時間、表面包覆材料的物理和化學性質、作用環境、給藥途徑和作用細胞的種類等，因而不能籠統地將功能化QDs定義為有毒或無毒，對不同型別功能化的QDs的生物毒性需要進行個體化的評價，重要的是首先要評價不同型別功能化QDs在達到醫學應用目的的劑量下是無毒或有毒。近年來有研究證明：將近紅外量子點(near-infrared quantum dots，NIR QDs)與RGD連線製備的NIR QD-RGD探針能與腫瘤新生血管內皮細胞表達的整合素αvβ3特異性地靶向結合，對體質量為20～25g的小鼠，每隻靜脈注射150～200pmol劑量的NIR QD-RGD探針能達到對體內腫瘤及腫瘤新生血管清楚的成像，對癌症的早期診斷，體內腫瘤成像和個體化治療具有巨大的發展前景，但目前還未見NIR QD-RGD的毒性研究報道。用於臨床的製劑，無論診斷和治療，常常需要重複使用，因此重要的是要評價NIR QD-RGD在達到醫學應用目的所需的劑量下重複使用時其毒性作用。本研究用發射波長為800nm 的NIR QDs(NIR QD800) 與RGD 肽段偶聯，製備NIRQD800-RGD 探針，探討200pmol劑量的NIRQD800-RGD對小鼠行靜脈單次和重複注射後是否對機體和細胞產生毒性作用，為NIR QD-RGD的進一步研究和向臨床應用轉化提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要試劑和儀器

　　QD800抗體連線試劑盒(Q22071MP，Invitrogen公司，美國)，RGD肽段(上海吉爾生化)，總蛋白定量試劑盒(A045-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001)、谷胱甘肽(GSH) 測試盒(A006-1) 和丙二醛(MDA)測試盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)。紫外分光光度計(DU-600，Beckman公司，美國)，透射電子顯微鏡(H-7500，日立公司，日本)，鐳射光散射儀(BI-200SM，Brookhaven公司，美國)，活體成像系統(Maestro EX IVIS，CRI 公司，美國)，全自動血細胞分析儀(XE2100，Sysmex公司，日本)，全自動生化分析儀(ModularDDP，Roche公司，德國)，冷凍離心機(Z233MK-2，HERMLE公司，德國)，光學顯微鏡(E100，尼康公司，日本)。

　　1.2 實驗動物

　　SPF級雄性BALB/C小鼠33只，鼠齡6～8周，體質量17～20g，購自重慶醫科大學實驗動物中心，恆溫恆溼條件下飼養，室溫(22±2)℃，空氣溼度(60±10)%，墊料、飼料和飲水均經滅菌處理，飼料和水自由攝取。所有實驗操作程式均經過重慶醫科大學實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批准。

　　1.3 QD800-RGD的製備

　　按照QD800抗體連線試劑盒實驗手冊提供的實驗步驟製備QD800-RGD。①量子點活化和洗脫：濃度為10mmol·L-1的雙功能SMCC溶液預熱15min (37℃)後取出14μL加入1.5mL的EP管內，然後加入濃度為4μmol·L-1的QD800液125μL，均勻混合，在室溫下活化反應1h後用NAP-5柱子洗脫反應樣本，收集有色的洗脫液約500μL。②RGD的還原和分離：RGD 肽段粉劑溶於300 μL、pH 為7.2～7.4的PBS液中，調整到濃度為1g·L-1，然後將6.1μL濃度為1mol·L-1的DTT液加入RGD溶液中，混合均勻，室溫下還原反應30min後加入20μL染料指示標記液，用NAP-5柱分離反應樣本，從洗脫出的第一滴著色樣本開始收集，共收集500μL。③偶聯和滅活：將以上收集的2種洗脫液混合均勻、室溫下偶聯反應1h，然後加入濃度為10mmol·L-1的2-巰基乙醇3μL，均勻混合後在室溫下滅活反應30min。④濃縮和純化：將1mL以上偶聯滅活後的樣本加入2個超濾離心裝置管中，每個管0.5 mL，超速離心15 min(7 000r·min-1)，收集各超濾離心膜內側20μL的偶聯樣本溶液，然後用Pierce柱行色譜分離，得純化的QD800-RGD。最後根據產品說明書提供的消光係數和測量波長算出純化的QD800-RGD濃度，其計算公式為：A=εcl(A 為吸光度值，ε為消光係數，c為分子濃度，l為光程)。

　　1.4 QD800-RGD和QD800特性檢測

　　分別各取濃度為16mmol·L-1的QD800-RGD和QD800溶液50μL，用雙蒸水稀釋100倍，超聲震盪後分別吸取各樣品懸液約50μL滴到有膜的銅網上，靜置10min後用濾紙吸去多餘的液體，待幹後用透射電子顯微鏡觀察QD800-RGD和QD800的分散性。然後再分別取QD800-RGD和QD800各200μL於樣品池內，用超純水稀釋至6mL，密封樣品池後用鐳射光散射儀檢測QD800-RGD和QD800的流體動力學直徑。

　　1.5 QD800-RGD 和QD800在小鼠體內分佈

　　SPF級雄性BALB/C 小鼠9只，隨機分為3組，每組3只。Ⅰ組透過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD液(含200pmol QD800)，Ⅱ組透過尾靜脈注射100μL (含200pmol)QD800，Ⅲ組透過尾靜脈注射100μL的PBS液。24h後斷頸處死小鼠，立即解剖取出腦、心、肝、脾、肺、腎、脛骨和胃，用PBS沖洗後濾紙吸乾，用Maestro EXIVIS行器官的熒光成像檢測(激發光：630nm;發射光：800nm)，觀察QD800-RGD和QD800在小鼠以上各器官的'分佈。

　　1.6 各組小鼠全血細胞計數和血清生化分析

　　24只SPF級雄性BALB/C小鼠隨機分成4組，每組6只。單次注射組小鼠在第1天透過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD (含200pmol QD800);單次注射對照組小鼠在第1 天透過尾靜脈注射100μL的PBS;重複注射組小鼠分別在第1和7天透過尾靜脈各注射100μL 的QD800-RGD (含200pmol的QD800);重複注射對照組小鼠分別在第1和7天透過尾靜脈各注射100μL的PBS。每天觀察1次小鼠的一般情況。第14天，將小鼠禁食不禁水12h後摘除眼球採血，每隻小鼠取血約1.2mL，分別裝入抗凝採血管和促凝採血管各約0.6mL。用全自動血細胞分析儀檢測抗凝管全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞。將促凝管中收集的血液立即離心6min (4℃、3 000r·min-1)分離得到血清，用全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶和血尿素氮。

　　1.7 各組小鼠臟器係數

　　24只小鼠取血後，立即脫臼處死，稱體質量，然後解剖取出肝、脾、腎和肺，用濾紙吸乾臟器表面的體液和血液後用電子天平稱質量，小鼠的臟器係數=臟器質量(g)/體質量(g)×100%。

　　1.8 各組小鼠肝、脾、腎和肺組織中氧化和抗氧化指標的檢測

　　24只小鼠的器官稱質量後，立即將肝、脾、腎和肺切分為2塊，將各器官的其中一塊用4℃ 生理鹽水沖洗3次，濾紙吸乾後準確稱質量，按器官質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿3min，將勻漿液低溫離心10 min (4℃、3 000r·min-1)，分別各取上清液用考馬斯亮藍法檢測各勻漿液的總蛋白濃度。然後用總SOD測試盒、GSH測試盒和MDA試劑盒分別測定肝、脾、腎和肺組織中的總SOD、GSH 活性和MDA含量，實驗嚴格按測試盒說明書進行。

　　1.9 各組小鼠組織病理學檢查

　　將另一塊肝、脾、腎和肺組織用4%多聚甲醛固定6h後行常規石蠟包埋，切割為4μm 厚的組織切片，HE染色後採用光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

　　1.10 統計學分析

　　採用SPSS 18.0軟體進行統計學分析。全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞，血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶和血尿素氮，器官體質量係數，總SOD、GSH活性和MDA含量均以x±s表示，組間比較採用單因素方差分析。

　　2 結果

　　2.1 QD800-RGD和QD800特性

　　本實驗獲得的QD800-RGD濃度為1.2μmol·L-1。電子顯微鏡下顯示：QD800-RGD 和QD800均有良好的分散性，均未發生團聚。QD800-RGD和QD800的平均流體動力學直徑分別為(23.83±5.24)和(16.67±3.81)nm。

　　2.2 QD800-RGD和QD800在小鼠體內分佈

　　經小鼠尾靜脈注射QD800-RGD和QD800 24h後，在小鼠肝、脾和肺內可以檢測到明顯的QD800熒光訊號存在，腦、心、腎、脛骨和胃內未見明顯的QD800熒光訊號，表明QD800-RGD和QD800靜脈注射後在體內器官的分佈相似。

　　2.3 各組小鼠的一般情況

　　各組小鼠均存活，進食、進水正常，大、小便正常，無舉尾、無皮膚及毛髮的顏色改變，無行動異常、無興奮和抑制反應。

　　2.4 各組小鼠臟器係數

　　QD800-RGD和PBS分別行單次和重複靜脈注射後各組小鼠的肝、脾、腎和肺的臟器係數比較差異均無統計學意義(P>0.05)

　　2.5 各組小鼠全血細胞計數

　　4組小鼠外周血中白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞檢測結果見表2。4組小鼠的各血細胞計數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

　　2.6 各組小鼠血清生化指標

　　4組小鼠血清生化指標檢測結果見表3。各組小鼠血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶和血尿素氮比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

　　2.7 各組小鼠肝、脾、腎和肺中SOD、GSH 活性和MDA含量

　　4組小鼠肝、脾、腎和肺組織中的SOD、GSH 活性和MDA含量檢測結果見表4。4組小鼠各器官的SOD、GSH 活性和MDA 含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

　　2.8 各組小鼠組織病理學檢查

　　HE染色結果顯示：單次和重複靜脈注射QD800-RGD組小鼠肝、脾、腎和肺組織均無壞死，細胞形態、數量及分佈與對照組比較無明顯差異。

　　3 討論

　　本研究採用的QD800為核-殼奈米結構，是以CdSeTe為核，ZnS為殼，外面連線末端帶氨基的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為外塗層。影響QDs毒性的因素很多，不同型別功能化QDs的毒性作用差異很大。有研究報道：QDs透過靜脈進入體內後首先與血液中的成分相互作用，引起多種炎症和血液因子(如白細胞、血小板和紅細胞等) 的改變。以往的研究證明：150～200pmol劑量的NIR QD-RGD 對體質量為20～25g的小鼠行靜脈注射能達到對腫瘤的視覺化成像。本研究對體質量為17～20g的每隻小鼠行單次和重複靜脈注射200pmol的QD800-RGD，每次注射劑量均超過QD800-RGD達到醫學應用目的的最大劑量，結果表明：QD800-RGD單次和重複靜脈注射14d後均未對小鼠產生血液學毒性作用。

　　目前研究認為：QDs產生毒性作用的機制是量子點釋放的重金屬離子(如Cd2+、Se2- 等)和QDs進入體內後可誘導細胞產生活性氧自由基，從而對細胞產生毒性作用。本實驗結果和以往的研究均證明：QD800-RGD靜脈注射後主要分佈於肝、脾和肺，由於腎是體內排洩器官，因此本研究重點觀察QD800-RGD進入體內後對肝、脾、肺和腎的毒性作用。血清中的蛋白(如總蛋白、白蛋白)和一些獨特的酶(天門冬氨酸氫基轉換酶和丙氨酸氨基轉換酶)及血尿素氮的水平是反映肝、腎功能的重要指標，當肝、腎器官發生炎症或損傷時以上指標會發生顯著性變化。本研究結果表明：小鼠單次和重複靜脈注射200pmol的QD800-RGD後未產生肝腎功能的損害。

　　活性氧自由基與細胞的增殖、分化和凋亡等多種生理及病理現象密切相關，活性氧自由基的增多可引起脂質過氧化損傷，引起細胞膜破損，進而導致細胞凋亡或死亡。MDA 是細胞發生脂質過氧化反應中最具代表性的產物，其含量的多少可代表機體脂質過氧化的速率和強度，同時細胞內活性氧自由基的產生與清除是由多種酶組成的氧化還原系統完成的，SOD和GSH 是細胞內清除活性氧自由基的2種關鍵酶，因此MDA、SOD和GSH 常被作為研究機體氧化應激和抗氧化防禦的指標。本研究結果表明：單次和重複靜脈注射200pmol的QD800-RGD 未導致小鼠肝、脾、腎和肺組織中的SOD、GSH 活性和MDA 含量的顯著改變;同時組織病理學檢查也證明：單次和重複靜脈注射QD800-RGD後也未導致小鼠肝、脾、腎和肺的細胞損傷或壞死。

　　綜上所述，功能化的QDs種類多樣，其毒性作用差異很大，對不同種類功能化的QDs的生物毒性需要進行個體化的評價。本實驗首次證明：QD800-RGD在達到醫學成像所需的劑量下重複靜脈注射，在小鼠體內未導致明顯的急性毒性作用，為QD800-RGD的進一步研究和向臨床應用轉化提供了重要依據。需要進一步研究的問題是：由於QDs進入體內的毒性與劑量有密切關係，需要進一步研究確定機體毒性與QD800-RGD的劑量的依賴性關係;QD800-RGD進入體內後的長期毒性作用以及具體代謝過程。